分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1040
-
1047
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1040
-
1047
Copyright © 2016 BioPublisher 1045
用量按照
pENTR™/SD/D-TOPO® TOPO Cloning
Kit (
美国
Invitrogen
公司
))
说明书并参照文献
(
田莉
莉等
, 2012; 2013; 2014)
进行，加样混匀后置于温箱
内
25
℃反应
25 min
后，用热激法对
E. coli
Top10
感受态细胞
(
本实验室制备
)
进行转化。无菌条件下
将转化后的细胞均匀涂布在含
75 mg/L
卡那霉素
(Kanamycin, Kan)
的固体
LB
培养基上，将涂有菌液
的培养皿倒置，
37
℃过夜培养，将单克隆挑至
Kan
浓度相同的
LB
液体培养基内，震荡培养
14 h (
培养
条件为
37
℃
, 150 r/min),
以菌液为模板用
2
对引物
(GV-F&GV-R
和
M13-F&GV-R)
进行
PCR
扩增，将
扩增产物条带正确的克隆委托上海生物工程技术
服务公司测序，序列正确的阳性克隆命名为入门克
隆载体
“pEN-GV”
。
3.4 RNA
干扰载体的构建及鉴定
将目标载体
Phellsgate12(
澳大利亚
CSIRO
公司
产品
)
和步骤
3.3
获得的入门克隆载体
“pEN-GV”
进
行
LR
反应，具体参照
Gateway® LR Clonase® II
Enzyme Mix Kit (
美国
Invitrogen
公司
)
说明书及文
献
(
田莉莉等
, 2013; 2014)
进行，采用
10 μL
的反应
体系，加样混匀后置于
25
℃温箱内
12 h
后终止反
应
(
加入蛋白酶
K)
。热激法转化
E. coli
Top10
感受
态细胞
(
由本实验室制备
)
后，在含
100 mg/L
壮观霉
素
(
Spectinomycin
, Spec)
的
LB
固体培养基上涂布均
匀，将涂有菌液的培养皿倒置，
37
℃培养
16 h
后，
将获得的单克隆接种在含
Spec
浓度相同的
LB
液体
培养基，震荡培养
14 h (37
℃
, 150 r/min)
。以菌液为
模板进行
PCR
初检，试验所用特异引物为
GV-F&
GV-R
，
1.0%Agarose
凝胶电泳后，对扩增出预期片
段
(GV)
大小的菌液和
Phellsgate12
菌液抽提质粒，
进行进一步的单酶切鉴定，试验所用内切酶为
Xho
Ⅰ和
Xba
Ⅰ
(
均为
Takara
产品
)
，切出预期条带的阳
性质粒命名为
“Ph12-GV”(RNA
干扰载体
)(
图
8)
。
3.5 RNA
干扰载体对农杆菌的转化及鉴定
将步骤
3.4
获得的“
Ph12-GV
”载体质粒，采
用冻融交替方法对农杆菌菌株
EHA105
感受态细胞
(
由本实验室制备
)
进行转化，在添加
50 mg/L
利福
平
(Rifampicin, Rif)
和
100 mg/L Spec
的
YEB
固体培
养基上涂布均匀，将涂有菌液的培养皿倒置，置于
28
℃温箱内培养
46 h
，将获得的单克隆接种在至含
有相同浓度的
Rif
和
Spec
的
YEB
液体培养基，进
行震荡培养
36 h (28
℃
, 180 r/min)
。以菌液为模板用
2
对引物
(GV-F&GV-R
和
NPT
Ⅱ
-F& NPT
Ⅱ
-R)
分别
进行
PCR
扩增和
1.0%
琼脂糖凝胶电泳，鉴定为阳
性的克隆命名为“
EH-GV
”，可用于农杆菌介导的
植物遗传转化。
3.6
葡萄体细胞胚的诱导
花后
40 d
采集“红宝石无核”幼果，先用流水
冲洗果粒
5~10 min
，置于超净工作台上，用
75%
的
酒精浸泡
1 min
后无菌水冲洗
1
次，再用
0.1%
的
HgCl
2
浸泡
5~8 min
，无菌水漂洗
3
次，消毒后的果
粒置于灭菌培养皿中，无菌条件下纵剖果实，取出
胚珠，接种在“固
-
液双相”的
NN
培养基上
(
图
5A)
，
培养
6
周后无菌条件下纵剖胚珠，取出发育的合子
胚
(
图
5B)
，选择
1 mm
大小的幼胚接种在固体的
NN+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D
培养基上诱导
胚性愈伤组织，
4
周后将获得的胚性愈伤组织
(
图
5C)
接种在固体的
NN+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L
NAA
培养基上诱导发生体细胞胚，在胚性愈伤组织
表面选择发育阶段在子叶型期的体细胞胚
(
图
5D)
用于遗传转化。
3.7
农杆菌介导法转化葡萄体细胞胚及转基因植株
检测
将
EH-GV
菌液
28
℃震荡培养至
OD≈0.5
，
6 000 r/min
离心
10 min
后收集菌体，用等体积的
WPM
培养基重悬，将体细胞胚用农杆菌菌液浸泡
侵染
8~10 min
后，接种在
WPM
培养基上暗培养
3 d
，接种在
WPM+0.2 mg/L 6-BA+50 mg/L Kan+
200 mg/L Cef (
Cefotaxime
,
头孢霉素
)+200 mg/L
Carb (
Carbenicillin
,
羧苄青霉素
)
培养基上，每
2
周
继代一次，光周期为
16 h/8 h
，将抗性芽转至
1/2
MS+0.2 mg/L IBA+200 mg/L Cef+200 mg/L Carb
的
固体培养基培养
4~6
周，培养条件同上。选择生
根情况良好的幼苗，按照步骤
3.2
所述的方法抽
提植物的总
RNA
并合成第一链
cDNA
，再用该
cDNA
为模板进行
RT-PCR
扩增，引物分别为用
于扩增葡萄内参基因
Actin (AF369524.1)
的引物
Actin-F&Actin-R(
目标片段
216 bp)
，用于扩增干
扰片段的引物
GV-F&GV-R
，产物用
1.0% Agarose
进行凝胶电泳分析。
图
8 RNAi
表达载体
Ph12-GV
的结构
Figure 8 Construction of the RNAi vector Ph12-GV
