分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1040
-
1047
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1040
-
1047
Copyright © 2016 BioPublisher 1044
表
1 PCR
扩增所用引物
Table1 Primers used for PCR amplification
引物名称
Primer name
引物序列
(5'-3')
Primer sequence
备注
Notes
P1
ATGGGTGATGAGCTTTGATGC
GFLV
上游引物
The upstream primer of GFLV gene
P2
TGCCCGTCAAACACGTGAAA
GFLV
下游引物
The downstream primer of GFLV gene
P3
GGTAAACTAGTGATGAACG
GLRAV-3
上游引物
The upstream primer of GLRAV-3 gene
P4
TAGTTGGAAGACGTTGTGTAAG
GLRAV-3
下游引物
The downstream primer of GLRAV-3 gene
P5
AGGATGCGCACATTGAGTGTTG
GVA
上游引物
The upstream primer of GVA gene
P6
TAAGCCCGACGCGAAGTCGAA
GVA
下游引物
The downstream primer of GVA gene
P7
ATAGGAGATAAGGTAGGTGGCA
GVB
上游引物
The upstream primer of GVA gene
P8
TAGACTCTCAAGCTTGCTAA
GVB
下游引物
The downstream primer of GVA gene
GV-F
CACCATGGGTGATGAGCTTTGA
GV
上游引物，
CACC
为
TOPO
克隆所需序列接
头
The upstream primer of GV gene fragment
GV-R
TAGACTCTCAAGCTTGCTAA
GV
下游引物
,
同
P8
The downstream primer of GV, the same as P8
M13-F
GTAAAACGACGGCCAGT
通用引物
The universal upstream primer
NPT
Ⅱ
-F
ACAATCGGCTGCTCTGATG
NPT
Ⅱ上游引物
The upstream primer of
NPT
Ⅱ
gene
NPT
Ⅱ
-R
TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
NPTt
Ⅱ下游引物
The downstream primer of
NPTt
Ⅱ
gene
Actin
-F
CCCCCATGCTATCCTTCG
Actin
基因上游引物
Actin
-R
AGGCAGCTCATAGTTCTTCTC
Actin
基因下游引物
回收纯化试剂盒
(Takara
产品
)
回收后连接到
PMD19-T Vector (Takara
产品
)
、测序，获得的重组
质 粒 分 别 命 名 为
P19T-GFLV, P19T-GLRAV-3,
P19T-GVA
和
P19T-GVB
。利用重叠延伸
PCR
方法
将上述
4
个基因的保守区段顺序串联
(
技术路线见
图
7)
，获得的大片段
(
命名为
“GV”)
转入
PMD19-T
载体后，采用位于序列两端的引物
(P1
和
P8)
进行
PCR
扩增和琼脂糖凝胶电泳，将阳性克隆
(
出现
825
bp
条带
)
委托上海生物工程技术服务公司测序，序
列完全正确的克隆命名为
“P19T-GV”
。
3.3
入门克隆载体构建及鉴定
以
GV-F(5'
端加上序列接
„CACC‟)
和
GV-R
为
上、下游引物，对
3.2
所得
“P19T-GV”
质粒进行
PCR
扩增
(
所用聚合酶为
pfu
酶
, Fermentas
产品
)
，进行
PCR
扩增，退火温度
56
℃，
PCR
产物经
1.0%
的
图
7
利用重叠延伸
PCR
获得目的基因干扰片段的技术路线
Figure 7 The technology sketch of obtaining the interference
fragment of target gene using via overlapping PCR
Agarose
凝胶电泳后将目标条带切胶回收后进行
TOPO cloning
，本试验采用
6 μL
反应体系，各组分
