分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1040
-
1047
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1040
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Copyright © 2016 BioPublisher 1043
2
讨论
通过本研究，我们成功构建了含
4
种病毒
CP
基因片段
RNAi
载体，并转化葡萄体细胞胚获得了
RT-PCR
检测为阳性的转基因植株，有助于果树抗
病基因工程研究。
在病毒的进化过程中，外壳蛋白基因序列具有
高度的保守性，这种序列的保守性有助于维持其侵
染寄主的稳定性。因此，利用植物病毒来源的基因
构建载体进行遗传转化一直是植物获得抗病性的
主要方法，也是葡萄抗病毒基因工程的主要策略。
目前已成功转入葡萄的基因多为病毒的外壳蛋白
基因，如
GCMV
、
GFLV
、
GLRaV-2
、
GLRaV-3
、
GVA
和
GVB
等的
CP
基因
(Le Gall et al., 1994;
Krastanova et al., 1995; Valat et al., 2006)
，其中研究
最多的是
GFLV
的
CP
基因
(
任芳等
, 2013)
，转入的
基因多为单一病毒完整的
CP
基因。
近年来，利用
RNAi
这一技术策略进行葡萄抗
病毒基因工程的研究始有报道
(
田莉莉等
, 2012;
2014)
。前人的研究表明，转化不同病毒外壳蛋白
基因的全部或部分片段，均能获得抗病的转基因植
株
(
朱常香等
, 2008)
。而选取病毒基因组中相对保守
的序列作为
RNAi
的靶片段，既可以获得抗多个病
毒株系的转基因植株，又可以减少因病毒变异造成
的转基因植株抗病性的丧失
(Xu et al., 2009)
，而且
转入较小的片段更利于载体构建和遗传转化。考虑
到我国葡萄生产中同一植株受到多种病毒复合侵
染的情况十分常见
(
刘晓等
, 2006)
，我们分别从
4
种
存在广泛的葡萄病毒外壳蛋白基因
(GFLV, GLRaV,
GVA
和
GVB)
之中，克隆了其保守区段，经顺序串
联形成干扰片段，并用
Gateway
方法构建了
RNAi
载体，转入农杆菌中获得了可用于植物遗传转化的
工程菌，最终目的是通过转基因途径获得能同时抵
抗这几种病毒病害的转基因植物新材料。
自上世纪九十年代以来，葡萄转基因技术的研
究一直受到国内外研究者的关注。但与其它植物相
比，进展相对缓慢。究其原因，再生效率低是限制
葡萄遗传转化发展的瓶颈。一般认为，葡萄的再生
体系主要有器官发生和胚状体发生两种途径，由于
后者具有单细胞起源、不易产生嵌合体等优点，在
遗传转化中具有更大的利用价值。根据已有的文
献，迄今获得的转基因葡萄大多是通过胚状体发生
途径获得的
(Dhekney et al., 2008; Fan et al., 2008;
Gambino et al., 2010; Krastanova et al., 1995; Mauro
et al., 1995)
。前人的研究表明，葡萄的许多部位如
子房
(Pradoa et al., 2010)
、花药
(Pradoa et al., 2010;
Dhekney et al., 2012)
等都能诱导发生体细胞胚，并
以花药诱导产生的胚状体用于遗传转化的研究最
为常见。同时，也有研究者指出，合子胚与体细胞
胚具有相似的系统发育进程，是用于胚体发生和遗
传转化的理想的原初外植体
(Li et al., 2008)
。本研究
以
“
红宝石无核
”
葡萄通过合子胚诱导发生的体细胞
胚作为受体材料，成功进行了葡萄的遗传转化，进
一步丰富了葡萄转基因的受体材料来源。
在植物遗传转化过程中，筛选培养基中卡那霉
素
(
Kan
)
的浓度是决定转基因成败的关键。
Dhekney
(2008)
在对圆叶葡萄的体细胞胚进行遗传转化研究
时指出，
Kan
在
100 mg/L
能较好地抑制非转化子的
生长。我们的研究中分别在体胚萌发培养基和生根
培养基中添加了
50 mg/L
和
25 mg/L
的
Kan
作为选
择压，这是因为，我们在前期的试验中发现，
“
红
宝石无核
”
的体细胞胚对
Kan
比较敏感，当培养基
中加入的
Kan
浓度偏高时，绝大多数体细胞胚不能
萌发，或萌发后的抗性芽发育畸形不能成苗，这可
能是由于葡萄种间差异或体胚来源上的差异造成
的。
RT-PCR
检测结果显示转基因植株为阳性，表
明目的基因片段已成功转入受体细胞中并在
RNA
水平上得到表达，说明该技术路线是可行的。
3
材料与方法
3.1
材料
提取总
RNA
所用的葡萄品种为
“
藤稔
”
，
6
年生
树，叶片采自郑州果树研究所，转基因所用受体材
料为
“
红宝石无核
”
葡萄诱导发生体细胞胚。
3.2
干扰片段的获得
依据
NCBI
数据库发布的基因序列信息
(GFLV
CP
基因
,
登录号为
AY780901.1; GLRaV-3 CP
基因
,
登录号为
HQ401017.1; GVA CP
基因
,
登录号为
AB039841.1; GVB CP
基因
,
登录号为
AB039842.1)
，
参照文献
(
田莉莉等
, 2012; 2013; 2014)
在各自的保
守区域设计引物
(
序列信息见表
1)
。从田间采集幼嫩
的葡萄叶片，用
Trizol
抽提植物总
RNA
，取
1ug
RNA
，参照
M-MLV
反转录酶
(Takara
产品
)
说明书，
反转录合成
cDNA
第一链，并用该
cDNA
为模板进
行
PCR
扩增和电泳分析
(Agarose
浓度为
1.0%)
，具
体步骤参照文献
(
田莉莉等
, 2013)
进行。在紫外灯下
切下目标条带，用
DNA
