分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1040
-
1047
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1040
-
1047
Copyright © 2016 BioPublisher 1041
(RNAi,
一种特异性靶基因沉默技术
)
进行的植物基
因工程育种，已成为近年来培育抗病毒植物最有效
的技术策略之一
(Smith et al., 2000;
朱常香等
,
2008)
。但截止目前，将
RNAi
抗病毒策略应用于葡
萄基因工程的研究还不多见。
本研究针对生产中广泛存在的
4
种危险性病
毒，葡萄扇叶病毒
(
Grapevine fanleaf virus
, GFLV)
、
葡萄卷叶病毒
(Grapevine leafroll virus
, GLRaV-3)
为
我国葡萄的主要致病类型
(
蔡文启等
, 1997)
葡萄病
毒
A (
Grapevine leafroll virus A
, GVA)
和葡萄病毒
B
(
Grapevine leafroll virus B
, GVB)
，分别克隆它们的
外壳蛋白
(
coat protein,
CP)
基因保守区段，将这些区
段进行串联，再将串联之后的片段作为干扰片段，
用于
RNA
干扰表达载体的构建；并利用根癌农杆
菌介导的方法对葡萄体细胞胚进行遗传转化，诱导
转基因植株在体内形成
dsRNA
，通过沉默入侵病毒
的外壳蛋白基因阻碍其侵染过程，从而获得具有抗
病毒特性的新种质
(
材料
)
。
1
结果与分析
1.1
干扰片段获得
用葡萄总
RNA
反转录获得的
cDNA
作为
RT-PCR
反应的模板，克隆获得了
4
个目的基因区
段，分别位于
GFLV
、
GLRAV-3
、
GVA
和
GVB
这
4
个病毒的
CP
基因保守区域。核苷酸序列比对、
分析结果显示：本试验所获得的
GFLV CP
基因的
克隆片段长为
221 bp
，与登录号
AY780901.1
的全
长基因一致性为
91.3%
；获得的
GLRAV-3 CP
基因
片段长为
201 bp
，与登录号
HQ401017.1
的全长基
因一致性为
92.5%
；获得的
GVA CP
基因片段长为
204 bp
，与登录号
AB039841.1
的全长基因一致性为
89.1%
；获得的
GVB CP
基因片段长为
199 bp
，与
登录号
AB039842.1
的全长基因一致性为
91.9%
。
将这
4
个片段顺序连接之后，序列测定结果显示获
得的大片段
GV
长度为
825 bp (
图
1)
。
图
1
串联基因片段
GV
序列
Figure 1 Sequence of the tandem gene fragment of „GV‟
1.2
入门载体构建及鉴定
将连接后得到的片段
“GV”
进行
TOPO Cloning
之后，用菌液进行
PCR
扩增的结果
(
图
2)
：当以
GV-F
和
GV-R
为引物进行
PCR
扩增后，其阳性克隆的扩
增产物电泳可见约
825 bp
的条带，与预期片段大
小相符合；而在以
M13-F
和
GV-R
作引物进行
PCR
扩增后，电泳后出现的片段明显比插入片段要大，
结果表明
GV
片段连接进入到载体
pENTR/SD/D-
TOPO
中，即通过该步骤成功构建了入门克隆载体。
进一步的核苷酸测序结果表明，
“pEN-GV”
上的连
接片段与前期获得的
“GV”
片段相似度为
100%
，证
实了该干扰片段以正确的方向插入到入门载体中。
图
2 TOPO Cloning
阳性克隆的
PCR
鉴定
注
: M: DL2000 marker; 1:
阳性克隆以
M13-F&GV-R
作引物
PCR
扩增
; 2:
阳性克隆以
GV-F&GV-R
作引物
PCR
扩增
Figure 2 PCR identification of positive clones of TOPO
cloning products
Note: M: DL2000 marker; 1: Amplification of PCR products
with a positive clone using primers of M13-F&GV-R; 2:
Amplification of PCR products with a positive clone using
primers of GV-F&GV-R.
1.3 RNAi
载体构建及鉴定
本研究对
PCR
检测为阳性
(
电泳出现约
825 bp
条带
)
的阳性质粒进行酶切鉴定的结果
(
图
3)
：重组
质粒在经
Xho
Ⅰ和
Xba
Ⅰ单酶切后，切下的片段大
小约为
900 bp
，与未经
LR
反应的空载
Phellsgate12
酶切片段的大小明显不同，而空载经
Xho
Ⅰ酶切片
段大小为
1 429 bp
、经
Xba
Ⅰ酶切片段大小为
1 419
bp
，各酶切片段的大小符合预期结果。这表明，本
试验所构建的
RNAi
载体中，干扰片段
“GV”
形成了
正确的
Hairpin
结构。
1.4 RNAi
载体转入农杆菌及鉴定
用
“Ph12-GV”
质粒转化
Agrobacterium
菌株
EHA105
以后，用不同引物进行
PCR
鉴定的结果
(
图
4)
，用
GV-F&GV-R
作引物时，阳性克隆
PCR
扩增
产物电泳出现了与干扰片段大小一致的片段
(
图
4A)
；用
NPT
Ⅱ
-F & NPT
Ⅱ
-R
作引物时，
PCR
扩增
产物电泳出现了
714 bp
大小的条带
(
图
4B)
，片段大
小均符合预期结果，由此说明
“Ph12-GV”
已转入根
癌农杆菌中。
