分子植物育种 - page 6

分子植物育种(网络版), 2016 年, 第 14 卷, 第 1040- 1047 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1040- 1047
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图 3 目标载体 Ph12-GV 的酶切鉴定
注: 3-A: XholⅠ酶切鉴定; 3-B: Xba Ⅰ酶切鉴定; M: DL2000
marker; 1: Ph12-GV 阳性克隆酶切; 2: Phellsgate12 空载酶切
Figure 3 Restriction enzyme identification of the target vector Ph12-GV
Note: 3-A: Restriction enzyme identification of Xhol Ⅰ; 3-B:
Restriction enzyme identification of Xba Ⅰ ; M: DL2000
marker; 1: Enzyme digestion of the positive clones from
Ph12-GV; 2: Enzyme digestion of the empty vector Phellsgate12
图 4 Ph12-GV 转化农杆菌菌株 EHA105 阳性克隆的 PCR 鉴定
注: A: GV-F&GV-R 作引物 PCR; B: NPTⅡ-F& NPTⅡ-R 作引
物 PCR; M: DL2000 marker; 1: EHA105 空载 PCR; 2-3: EH-GV
阳性克隆 PCR
Figure 4 PCR identification of Ph12-GV positive clones
transformed into Agrobacterium strain EHA105
Note: A: PCR products using primers of GV-F&GV-R; B:
PCR products using primers of NPTⅡ -F& NPTⅡ -R; M:
DL2000 marker; 1: PCR products of EHA105 empty
vector； 2-3: PCR products of EH-GV positive clones.
1.5 根癌农杆菌介导法转化葡萄体细胞胚及转基因
植株的 RT-PCR 检测
农杆菌介导法转化合子胚起源的葡萄体细胞
胚的过程(图 5)，转化后的体胚进一步培养在添加
50 mg/L 卡那霉素的筛选培养基上(图 5E)，多数转
化后的体细胞胚在继代培养过程中生长缓慢或变
褐死亡，少数萌发后形成了抗性芽(图 5F)，部分抗
性芽在生根培养基上继续培养后生长停滞或死亡，
仅有少数生长正常的抗性芽在离体条件下生根(图
5G)，并形成完整植株(图 5H) 。提取再生植株幼嫩
叶片中的总 RNA，RT-PCR 结果(图 6)显示，当用内
参基因的引物(Actin-F&Actin-R)进行扩增后，对照
植株和转基因植株都能扩增出 216 bp 大小的预期
条带，而以 GV-F&GV-R 作引物时，对照植株的
cDNA 扩增后电泳未见条带，转基因植株明显可见
扩增片段(条带大小约为 825 bp)，显示前期构建的
RNAi 载体所携带的外源基因片段已转入到受体材
料葡萄体细胞胚中，并在转基因植株的 RNA 水平
上获得表达。
图 5 根癌农杆菌介导法转化“红宝石无核”葡萄体细胞胚
注: A~D: “红宝石无核 ”葡萄合子胚的获得及体细胞胚的诱
导发生; E~H: 体细胞胚遗传转化及再生植株的获得
Figure 5 Somatic embryo tranformation of Ruby Seedless
grape by Agrobaterium mediated method
Note: A~D: Somatic embryos induced from zygotic embryos
rescued from „Ruby Seedless‟ grape; E~F: Transformation of
somatic embryos by Agrobaterium and plant regeneration
图 6 转基因植株的 RT-PCR 检测
注: M: DL2000 marker; 1: 未转化植株以 GV-F&GV-R 作引
物 RT-PCR; 2: 未转化植株以 GV-F&GV-R 作引物 RT-PCR;
3, 5, 7, 9: 转基因植株以 Actin-F&Actin-R 作引物的 RT-PCR;
4, 6, 8, 10: 转基因植株以 GV-F&GV-R 作引物的 RT-PCR
Figure 6 RT-PCR detection of the transformed plants
Note: M, DL2000 marker; 1: RT-PCR of untransformed plants
using Actin-F&Actin-R as primers; 2, RT-PCR of
untransformed plants using GV-F&GV-R as primers; 3, 5, 7, 9:
RT-PCR of transformed plants using Actin-F&Actin-R as
primers; 4, 6, 8, 10: RT-PCR of a transformed plants using
GV-F&GV-R as primers