分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1062-1071
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1062-1071
Copyright © 2016 BioPublisher 1066
2 ZFNs
、
TALENs
和
CRISPR-Cas
技术在植
物中的应用进展
2005
年，
Lloyd
等
(Lloyd et al., 2005)
将包含热
激启动子驱动的
ZFNs
编码基因和该
ZFN
的靶向识
别序列的载体转入拟南芥基因组，然后通过热激处
理
T1
代转基因苗，促使编码
ZFNs
的基因表达，造
成
ZFN
识别的靶位点序列的突变，第一次证明
ZFNs
可以在植物体内正常工作。随后也在拟南芥
(Zhang et al., 2010)
、烟草
(Townsend et al., 2009)
、玉
米
(Shukla et al., 2009)
、大豆
(Curtin et al., 2011)
等植
物内源基因的靶向编辑上得到成功的应用
(
表
2)
，但
是由于该技术合成组装难度大、修饰效率低、脱靶
效应高等问题使其在植物中的应用进展缓慢。
2009
年，黄单胞菌效应子蛋白
TAL
效应子与
寄主靶基因
DNA
特异识别的分子密码的破译，使
植物基因组靶向编辑呈现新的曙光
(
赵开军和杨兵
,
2012)
，
2010
年，
Christian
等
(2010)
首先通过酵母
实验证明
TALENs
的活性，并构建
TALENs
对拟南
芥
ADH1
基因进行了靶向编辑，随后，
Cermak
等
(2011)
利用高效
Golden Gate
方法构建
TALENs
，在
拟南芥原生质体中对
ADH1
进行了编辑，同年，
Mahfouz
等
(2011)
优化了
TAL
效应子
Hax3
的基因
序列，然后与核酸酶
Fok
Ⅰ的
DNA
切割域的编
码基因融合组成杂合核酸酶
dHax3.N
，将携带有
35S::ATG.EBE.TGA.spacer.EBE::uidA
和
35S::dHax
3.N
双元载体的农杆菌共浸染烟草叶片进行瞬时表
达，也证明了
TALENs
能够在植物细胞内对靶基因
进行定点剪切。
2012
年，
Li
等
(2012)
利用
TALENs
技术将水稻感病基因
Os11N3(
或称为
OsSWEET14)
启动子序列进行靶向编辑，使水稻白叶枯病原菌
T
AL
效应子
AvrXa7
和
PthXo3
失去对
Os11N3
启动
子靶点序列的识别，从而使水稻的抗病能力提高，
展示了该技术在作物改良中的广阔应用前景。随后
TALENs
也成功对烟草
(Zhang et al., 2013)
、短柄
草
(Shan et al., 2013b)
、小麦
(Wang et al., 2014)
、
大豆
(Haun et al., 2014)
等多种植物内源基因进行
编辑
(
表
2)
。
2013
年，基于原核生物Ⅱ型
CRISPR-Cas9
系
统而开发的一种新的靶向基因组编辑技术的出现，
给基因工程带来技术性的革命
(Zhang and Zhou,
2014)
，相对比
ZFNs
和
TALENs
该技术更简单，直
接和高效等优点，其应用和发展非常迅速。在
2013
年
8
月的《
Nature biotechnology
》期刊上三篇文章
分别报道了利用
CRISPR-Cas9
技术对单子叶植物
水稻、小麦和双子叶植物烟草、拟南芥的多个内源
基因成功进行靶向编辑，
Shan
等
(2013a)
利用该技术
对水稻的
4
个基因
(OsPDS; OsBADH2; Os02g23823
和
OsMPK2)
和小麦
1
个基因
(TaMLO)
进行定点突
变，在转基因水稻中基因突变效率为
4.0%~9.4%
，
并在
T0
代就可获得
PDS
基因敲除的水稻纯合突变
体，还实现了利用
HR
修复途径在特定突变位点精
确插入一段包含的两个限制性酶切位点的序列；展
示了该技术在重要粮食作物中的应用前景；
Li
等
(2013)
利用该技术分别在拟南芥和本氏烟中实现了
靶基因的定点突变
,
突变效率为
1.1%~38.5%
之间，
分别成功对两个基因
(AtRACK1b
和
AtRACK1c)
和
同一个基因
(AtPDS3)
的两个不同位点同时进行编
辑；
Nekrasov
等
(2013)
利用
CRISPR-Cas
技术在本
氏烟中实现了基因组的定点突变
,
突变效率为
1.8%~2.4%
；同年，北京大学瞿礼嘉实验室
(Miao et
al., 2013)
利用该技术对水稻的叶绿素加氧酶基因
1(CAO1)
和散生基因
(LAZY1)
进行定点突变，突变
效率分别高达
83.3%
和
91.6%
；中科院上海植物逆
境生物学研究中心朱健康实验室
(Feng et al., 2013)
利用
CRISPR-Cas
技术分别对拟南芥和水稻实现了
基因的定点突变
,
突变效率
(
除了一个位点突变效率
为
5%
外
)
比较高，在
26%~84%
之间。此外，该技术
还成功对西红柿
(Brooks et al., 2014)
、甜橙
(Jia and
Wang, 2014)
等多种植物内源基因进行编辑
(
表
2)
，
目前该技术已成为了植物研究的一种热门手段，本
实验室也正在利用该技术在水稻基因功能研究中
开展相关工作。
3
问题和展望
靶向基因组编辑技术是植物基因功能解析和
农作物改良中最直接的手段，近年，随着高通量
DNA
测序技术的发展以及众多植物基因组测序工
作的完成，通过基因组靶向编辑可以直接在基因组
特定位点实现基因序列的改变以阐明基因的功能，
另一方面，可以应用该技术对一些控制重要农艺性
状的基因进行编辑来改良或改造农作物，并可在后
代的自交或回交等中较容易去除转基因的成分，既
可以避免常规转基因技术基因插入位点的不确定
性，还可以避免常规转基因作物存在的生态和食品
安全风险，有望成为农作物转基因育种的新方法。
ZFNs
、
TALENs
和
CRISPR-Cas
技术在以上两个
方面都展现出了较好的应用前景，在经过长期探索，
三种技术得到优化和发展，但仍然存在一些问题需要
解决和探讨：
1)
都存在脱靶效应，如何避免脱靶效应
和增加其特异性？一方面可能继续对靶向编辑技术
中
DNA
结合域特异识别
DNA
的分子机制进行进一
步深入研究，优化或改进基因组靶向编辑载体使其特
异性更高，另一方面可以通过高通量的方法
(
如测序
技术、生物信息学等
)
预测和筛选最合适的靶位点，
以尽量避免可能的脱靶效应，例如在
CRISPR-Cas
系
统设计
sgRNA
靶序列识别位点时，针对一些模式植
物已经有网站可以查找和设计较为合适的靶位点和
预测可能脱靶位点
(Lei et al., 2014)
；
2)
目前基因组靶
