分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1062
-
1071
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1062
-
1071
Copyright © 2016 BioPublisher 1065
个嵌合的
sgRNA (small guide RNA)
分子，通过体外
实验证明了该
sgRNA
能使Ⅱ型系统的
Cas9
蛋白能
够识别特定的
DNA
序列，并引起
DNA
的
DSBs
，
为以后
CRISPR-Cas
系统应用于基因组靶向编辑开
创了里程碑的工作。
2013
年
2
月，两个实验室分别
利用该技术成功对人和小鼠细胞的内源基因实现
靶向编辑
(Cong et al., 2013; Mali et al., 2013)
，此后，
该技术在其他物种的应用也竞相报道。
目前，基于Ⅱ型的
CRISPR-Cas9
系统而改造的
基因组编辑技术只需要根据靶
DNA
位点合成一段
能够编码大约
100 nt sgRNA
的序列和一个
Cas9
蛋
白两种主要元件。对不同的基因位点，仅需要改变
编码
sgRNA
的序列，而不用重新构建或表达
Cas9
蛋白，并且可以将多个
sgRNA
串联可以对一个基
因的多个位点进行编辑或同时对多个基因进行编
辑，也可以在
RNA
水平上进行编辑
(O’Connell et al.,
2014)
。
CRISPR-Cas9
基因组编辑载体的构建也非常
简单、快速，通过常规的酶切、连接和克隆可在
1~3
天就完成构建工作，大大简化实验，在普通分子生
物学实验室就能实施。
1.4
三种基因组靶向编辑技术的特点
ZFNs
、
TALENs
和
CRISPR-Cas
技术在
DNA
靶点识别和结合域、剪切域、靶序列的大小、设计
难易程度、靶向修饰效率、脱靶率、多位点编辑难
易程度、构建所需要的时间和成本等方面进行比较
(Fichtner et al., 2014; Chen and Gao, 2014) (
表
1)
。
CRISPR-Cas9
无论是在设计、构建难易程度，还是
时间、成本，以及修饰效率上，显然优于
TALENs
和
ZFNs
两种技术，但是
CRISPR-Cas9
也存在自身
的局限性，比如选择
DNA
靶位点受限于
PAM
序列
不能对基因的任何位点进行编辑，另外还存在一定
的脱靶效应等问题。
表
1 ZFNs
、
TALENs
和
CRISPR-Cas9
技术特点的比较
Table 1 Comparison of ZFNs, TALENs and CRISPR-Cas9
项目
Subjects
ZFNs
TALENs
CRISPR-Cas9
靶点结合域
Binding domain
锌指
(ZFP)
结构域
ZFP domain
TALE
蛋白的
RVD
串联重复
区
TALE RVD repeats domain
CRISPR RNA
或小分子向导
RNA
CRISPR RNA or Small guide RNA
剪切域
Cleavage domain
Fok
Ⅰ
Fok
Ⅰ
Cas9
靶序列大小
length of target
sequence
(9~12 bp)*2
(8~31 bp)*2
20 bp+NGG
设计难易
Design difficulty
中等
Moderate
容易
Easy
非常容易
Very easy
构建难易
Construction
difficulty
难
Difficult
容易
Easy
非常容易
Very easy
载体构建时间
Time for construction
5~7
天
5~7 d
5~7
天
5~7 d
1~3
天
1~3 d
构建成本
Cost
高
High
中等
Moderate
低
Low
靶向修饰效率
Efficiency
低
low
高
High
高
High
多靶点编辑
Multiplexing
难
Difficult
难
Difficult
容易
Easy
RNA
编辑
RNA editing
不能
Incapable
不能
Incapable
能
Capable
脱靶率
Off-target rate
高
High
低
Low
依物种和
sgRNA
结构不同
According to different species and sgRNA
structures
