分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1062
-
1071
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1062
-
1071
Copyright © 2016 BioPublisher 1063
tabacum
L.) (Lee et al., 1990)
、拟南芥
(Arabidopsis)
(Hanin et al., 2001)
、百脉根
(
Lotus japonicas
)
(Thykjær et al., 1997)
、水稻
(
Oryza sativa
L.) (Terada
et al., 2002)
等多种模式植物内源基因的编辑中得到
成功应用，但是，由于该技术效率很低
(
在
10
-5
~10
-3
之间
) (Iida and Terada, 2005)
，严重制约了该技术在
高等植物中的广泛应用。
随后，科研人员根据真核生物转录调控因子
-ZFP (Zinc finger protein,
锌指蛋白
)
和植物病原菌的
一类分泌蛋白
-TALE (Transcription activator-like
effector,
转录激活效应子样效应因子
)
分别开发出了
ZFNs
和
TALENs
技术；以及最近基于原核生物的
适应性免疫系统而开发出的
CRISPR-Cas9
技术，前
两种技术通过特异的
DNA
结合蛋白与
DNA
靶位点
结合，在非特异性的核酸酶
Fok
Ⅰ的作用下引起生
物基因组靶位点
DSBs
。而
CRISPR-Cas9
则通过小
分子向导
RNA (small guide RNA)
以碱基互补配对
方式与
DNA
序列靶位点结合，引导
Cas9
蛋白到靶
位点并对
DNA
产生剪切作用，从而造成基因组靶
位点
DSBs
，形成的
DSBs
会启动真核细胞
DNA
修
复机制。通过两种方式
NHEJ (non-homologous end
joining,
非同源末端 连接
)
和
HR (homologous
recombination,
同源重组
)
修复断裂缺口
(Wyman and
Kanaar, 2006)
，在修复时可能会引起
DNA
序列的插
入、缺失或置换等，从而实现基因组靶向编辑，大
大提高了植物基因编辑的效率和简化了实验操作，
在植物基因功能研究和农作物改良中展现出广阔
的应用前景。本综述详细介绍这三种技术的基本结
构及其进行基因组靶向编辑的原理和比较其特点，
并着重介绍了三种技术在植物中的应用进展，并对
其进一步发展提出了展望。
1 ZFNs
、
TALENs
和
CRISPR-Cas
技术的结
构、原理及特点
1.1 ZFNs
技术
ZFNs
是由人工构建的锌指蛋白
(zinc fingers
proteins, ZFPs)
和非限制性核酸酶
Fok
Ⅰ两部分组成
(Bibikova et al., 2002)
。
ZFPs
是一类真核生物中普遍
存在的基因转录调控因子，在基因的表达调控、细
胞分化、胚胎发育和增强植物抗逆性等方面起非常
重要的作用
(
宋冰等
, 2010; Liu et al., 2011; Yu et al.,
2014; Zang et al., 2015)
。
每个锌指蛋白由多个锌指结构域组成，其中
Cys2-His2 (C2H2)
型锌指结构域在转录调控因子中
广泛存在。
Miller
等
(Miller et al., 1985)
最早发现并
阐述了
C2H2
型锌指结构域的功能，在全长为
344
个氨基酸的转录因子
TFIIIA
序列中，
13~276
位氨
基酸含有
9
个锌指结构域，每个锌指结构域由
30
个氨基酸组成，每个锌指结构域中
8
和
13
位的半
胱氨酸
(cysteine, Cys)
以及
26
和
30
位的组氨酸
(histidine, His)
非常保守，他们络合锌离子形成稳定
的指形结构，并折叠成
α-β-β
二级结构。
锌指蛋白特异识别和结合
DNA
是由于锌指的
α-
螺旋嵌入到
DNA
分子的大沟中直接同核苷酸的
碱基发生作用，
α-
螺旋上的
-1~+6
位上的氨基酸残
基赋予了锌指对
DNA
识别的特异性，其中
-1
、
3
、
6
氨基酸可以识别位于
DNA
同一条链上
3′
到
5′
方向
连续的
3
个碱基
(Pavletich and Pabo, 1991)
。这样每
个锌指单元可以识别
3
个连续的碱基，理论上替换
锌指
α-
螺旋上关键的氨基酸残基，保持锌指的基本
骨架不变，就可以产生识别不同序列的特异锌指单
元。将这些单元串联在一起就可以形成与长
DNA
序列结合且具有特定靶向性的锌指蛋白。人工构建
的锌指蛋白通常由
3~6
个
C2H2
型锌指单元串联组
成，识别
DNA
链上相连续的
9~18 bp
碱基，锌指
核酸酶的另一个组成元件是非特异的
Fok
Ⅰ核酸
酶，该酶是
IIS
型的限制性内切酶，只在二聚体状
态时才具有酶切活性
(Bitinaite et al., 1998)
，每个锌
指蛋白与
Fok
Ⅰ融合构成一个锌指酶单体
(ZFN)
，识
别特定的
DNA
位点。当两个单体识别的
DNA
位点
相距合适的距离时
(6~8 bp)
，两个锌指酶单体产生
酶切功能，从而对
DNA
双链产生剪切并引起靶位
点
DSBs
。
DSBs
诱发真核细胞的
DNA
损伤修复机
制，通过
NHEJ
修复
DSBs
，可能造成在
DNA
靶位
点随机性的碱基的插入或缺失等，引起基因序列的
改变，从而实现基因的靶向敲除。如果细胞中存在
与靶位点附近序列同源的
DNA
片段，也可能通过
HR
来修复
DSBs
，引起
DNA
序列的插入或互换，
从而实现基因敲除或敲入
(Gaj et al., 2013)
。
目前，人们已经开发出多种设计和组装锌指核
酸酶的方法，如：模块组装法
(modular assembly, MA)
(Wright et al., 2006)
；
OPEN
法
(oligomerized pool
engineering, OPEN) (Maeder et al., 2008)
和
CoDA
(context dependent assembly system, CoDA) (Sander
et al., 2011)
，此外，还有一些商业公司开发的方法，
如
Sangamo Biosciences
公司开发的具有知识产权
的双锌指模块组装方法等等。但是不管哪种方法，
锌指核酸酶合成和组装程序都比较复杂，价格较
贵，一般实验室较难实施。
1.2 TALENs
技术
TALENs
是继
ZFNs
之后的另一种较为灵活和
高效的靶向编辑技术
(Beumer et al., 2013; Chen et al.,
2013)
，
TALENs
在结构上与
ZFNs
类似，是由特异
性的
DNA
结合蛋白
-TALE
蛋白和
Fok
Ⅰ核酸酶两部
分组成
(Christian et al., 2010)
。
TALE
蛋白是植物病
原体
-
黄单胞菌
(Xanthomonas spp.)
分泌的一种转录
激活子样效应因子，是一类分泌蛋白，在植物细胞
中能够特异性地识别并结合寄主靶基因的序列，从
而调控寄主的基因表达
(Boch and Bonas, 2010)
。
