分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1008
-
1015
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1008
-
1015
1014
取健康单株的顶部嫩叶
20 g
。
3.2
线粒体、叶绿体提取
细胞器提取方法主要参考文献
(
曾秀存等，
2005
，田自华等，
2004)
，每克材料加入
5 mL
匀浆
缓冲液，在预冷的研钵中对材料进行研磨，保证整
个过程温度不超过
4
℃，四层纱布过滤，收集滤液。
滤液经
2 000 g
离心
15 min
后，取上清
12 000 g
离
心
10 min
，取沉淀，上述离心过程重复两次，最终
所得沉淀即为粗提线粒体和叶绿体。
3.3
叶绿体及线粒体
DNA
提取
在纯化后的线粒体和叶绿体沉淀中加入
2 mL
预热
CTAB
缓冲液，
65
℃裂解
1 h
，
12 000 g
离心
10 min
，吸取上清液；加入等体积的苯酚
-
氯仿
-
异
戊醇
(25:24:1)
，混合摇匀，
12 000 g
，离心
10 min
，
吸取上清；加入等体积的氯仿：异戊醇
(24:1)
，混
合摇匀，
12 000 g
，离心
10 min
，吸取上清；加入
2/3
体积的预冷异丙醇，冰浴
30 min
；
12 000 g
，离
心
1 min
，用
70%
酒精洗涤沉淀数次；将
DNA
风干，
加入
30μL TE
，
-20
℃保存备用。
3.4
测序及数据质控与过滤
DNA
经
Illumina Standard Protocol
，按
PE90
策略进行建库测序
(
/
sequencing/protocols.html)
。原始数据经去除测序
重复，由
Trimmomatic 3.0 (Bolger A., and F
Giorgi., 2014)
进行
Clean
处理后，用
Fastqc
(Andrews S., 2010)
对
Reads
进行质控检测。以
NCBI
数据库
(Boratyn., Grzegorz et al., 2013,
Johnson et al., 2008)
公布的萝卜核基因组，及
5
个
萝卜线粒体为参考基因组，用五个样品的原始测
序数据进行
BWA (Li and Durbin 2009)
比对
(mismatch=0)
。根据比对情况计算原始数据中细
胞核、线粒体及叶绿体组分的比率。根据比对文
件的
Sam (Li et al., 2009)
文件
Mapping flag
分
值，将不能比对的数据过滤适合叶绿体组装用
Reads
，并转换为
Fastqc
文档。
待叶绿体组基因组装完毕之后，以各样本的叶
绿体基因组为参考，用原始数据进行
BWA
比对
(mismatch=0)
。根据比对生成的
Sam
文件
Mapping
Flag
分值，将不能比对的数据过滤出适合线粒体组
装用
Reads
，并转换为
Fastqc
文档。
3.5Kmer
分析及基因组组装
对过滤的数据分别进行
Kmer
分析，确定适合组
装的
mer
值并预测测序深度及目标基因组的大小。
基因组大小的估测方法根据
Marcai
和
Kingsford (2011)
的方法，并加以改进。公式为：
用
Velvet
软件
(Zerbino and Birney., 2008)
对过
滤后的各样品数据进行组装，选择
mer
值为
21
，
Insert Size
为
320
，标准误
sd
为
10
，预期覆盖度、
截止覆盖度参数则为表
2
计算得到的预计覆盖
度。组装运行命令行为：
建立索引：
Velveth ./Assem21 21 -shortPaired
-Fastq in_fq1 in_fq2
组装
Contigs
：
Velvetg ./Assem21 -exp_cov
${exp_cov} -cov_cutoff ${cutoff} -ins_length 320
-ins_length_sd 10
3.6
提取
Sanger
测序及
Gapping Filling
根据组装得到的
Contigs
的侧翼序列
30 bp
设计
引物，以各样品在
3.2.2
提取的
DNA
样品为模板进
行
PCR
扩增，并对扩增产物用
Sanger
法测序。
将第一步组装的
Contigs
序列及扩增产物经
Sanger
测序后得到的序列进行叠加，得到新的
Scaffold
，并结合
IGV (Robinson et al., 2011)
的可视
化分析，进行手动拼接从而得到各自完整的全长基
因组序列。
最后用
Mitofy (Alverson et al., 2010)
软件对所
有基因组进行基因注释。
作者贡献
段乃彬完成测序数据处理，基因组组装，基
因注释及论文写作；王俊峰，白静及谢坤完成
DNA
提取，
PCR
扩增及
Sanger
测序以论文修
改；王效睦是项目的构思者及负责人，指导实验
设计，论文写作与修改定稿。全体作者都已阅读
并同意最终的文本。
致谢
本研究由山东省自然科学基金
(ZR2015YL054)
及山东省农业良种产业化开发项目农业生物资源
创新利用研究
“
萝卜地方品种雄性不育资源发掘与
种质创新利用研究
”
共同资助。
参考文献
Alverson A.J., Wei X., Rice D.W., Stern D.B., Barry K.,
and Palmer J.D., 2010, insights into the evolution of
mitochondrial genome size from complete sequences of
Citrullus Lanatus and Cucurbita Pepo (Cucurbitaceae),
(Molecular Biology and Evolution), 27(6): 1436-1448
