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董玉梅等：利用双向电泳方法初步分析大豆根、茎、叶蛋白质特点
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由此可知，重复性好的蛋白质双向电泳方法是
蛋白质功能和性质确定的重要保障。揭示植物不同
组织、器官的蛋白质功能是揭示生命活动规律和蛋
白质作用分子机制的直接和有力手段。结合图
1
、
图
2
和图
3
的结果和分析可知，大豆根、茎、叶总
蛋白质的分子量和等电点分布有较大差异，由此推
测大豆根、茎、叶蛋白质在应答各种生物或非生物
胁迫时的表现可能会从不同的角度补充解释大豆
抗性的分子机制，因此，本方法的建立是利用大豆
根、茎、叶蛋白组解析大豆应答各种胁迫的分子机
制的前提、是技术基础。而且，此法所分离到的蛋
白点比
Aghaei
等
(2009)
人分离的蛋白点
(300
多个
)
多，故本研究对进一步利用蛋白质组解析大豆应答
胁迫的相关分子机制奠定了基础。
3
材料与方法
3.1
植物材料的培养、取材及预处理
大豆品种郑
9525(
市售
)
，播种于装有花卉基质
的花盆
(
直径
24 cm)
，每天
12 h
光照
(25
℃
)/12 h
黑暗
(20
℃
)
光照培养室生长，大豆长至两对真叶完全展
开，备用。
取材，灭菌剪刀剪取大豆叶片，茎秆剪成约
1~2 cm
长，迅速置于-
80
℃冰箱保存备用；然后将大豆的根
从基质中小心取出，尽量保持完整，于自来水下冲
洗至干净，然后用滤纸将水吸干，再置于-
80
℃冰
箱保存备用。
3.2
大豆根、茎、叶双向电泳方法
3.2.1
大豆根、茎、叶蛋白样品制备及浓度测定
本研究所用的大豆根、茎、叶蛋白样品破碎方
法为液氮研磨
(
机械
)
法；蛋白沉淀方法为
TCA/
丙酮
(
有机溶剂
)
沉淀法
(
何华勤
, 2011)
，具体如下。
取预先灭菌、-
20
℃预冷的研钵置于冰上，称
取预先备好的植物组织
(
叶片
1 g;
根
,
茎各
1.5 g)
液
氮研磨后，转入
50 mL
灭菌的离心管中，每管加入
20 mL 10% TCA /
丙酮
(
用前现加
DTT 0.1%
质量
体积比
0.1g/100 mL)
；涡旋混匀，放置在试管架上
置于-
20
℃沉淀过夜
(14~18 h)
。
取出沉淀，于
4
℃，
20 000 rpm
，离心
20 min
，
弃上清收集沉淀；-
20
℃预冷的
80%
丙酮
(
现加
DTT
0.1%
和
PMSF 100 μL/10 mL) 20~25 mL/
管，涡旋并
重悬沉淀
(
作用是清洗蛋白
)
，置于-
20
℃沉淀
1~2 h
；
4
℃，
20 000 rpm
，离心
20 min
，弃上清，收集沉淀，
如此清洗蛋白
3
次，直至蛋白呈白色沉淀，弃上清，
循环水真空泵干燥
成粉末，转入灭菌的
2 mL
离心管
中，于-
80
℃冰箱保存备用。
蛋白质上样前必须测定
并调准
浓度。从-
80
℃取出
蛋白质干粉，分别称取
30 mg/
管
(1.5 mL)
，加入
450 μL
蛋白水化液
(15 μL/mg)
充分溶解蛋白粉末，
Bradford
(1976)
法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白制作的蛋
白标线斜率均在
99%
以上。如表
1
，按纵列顺序添
加①②③种试剂，分别读出空白对照及
1
、
2
、
3
、
4
、
5
、
6
管牛血清蛋白浓度为
0
、
0.1
、
0.2
、
0.4
、
0.6
、
0.8
、
1.0
，且斜率在
95%
以上才说明此蛋白标线制作
正确、能用于蛋白浓度的测定。
浓度测定时
(
见表
2)
，按纵列顺序分别向
10 mL
灭菌离心管中添加
G250
、水化液和蛋白样品，测定
并读数即可。
因核酸蛋白测定仪上显示的浓度是蛋白被稀
释
10
倍后的浓度，因此，蛋白的实际浓度是读数的
10
倍。记录好每个蛋白样品的浓度后，按照
17 cm
胶条的上样量将蛋白浓度调至
600 μg/300 μL
。
3.2.2 IPG
胶条溶胀及蛋白质一向电泳
(IEF)
将定量好的蛋白溶液
300 μL (
含蛋白
600 μg)
于室温，
20 000 rpm
，离心
20 min
，取上清转入水化
盘中
(
此步骤的目的是去除一些不容的杂质
)
，转入
IPG
胶条，于
20
℃水化
(
溶胀
)
过夜。溶胀完全的胶条
转入等电聚焦仪
(PROTEAN IEF Cell, BIO-RAD)
，
进行聚焦
(
表
3)
。
表
1
蛋白标线制作试剂表
Table 1 Reagents needed by stand curve of protein
序号
No.
试剂
Reagent
空白
Blank control
1
2
3
4
5
6
①
G250 (mL)
5
5
5
5
5
5
5
②
Lysis buffer (μL)
100
90
80
60
40
20
0
③
BSA
溶
液
(μL)
0
10
20
40
60
80
100
BSA concentrationug (μL) 0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
分子植物育种
F
enzi Zhiwu Yuzhong