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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1013
表
2
根、茎、叶蛋白质浓度测定
Table 2 Concentration of the proteins extracted from roots, stems and leaves of soybean
茎
A1
StemA1
茎
A2
StemA2
茎
A3
StemA3
叶
B1
LeafB1
叶
B2
Leaf B2
叶
B3
Leaf B3
根
T1
Root T1
根
T2
Root T2
根
T3
Root T3
样品体积
(μL)
Volume (μL)
10
10
10
10
10
10
10
10
10
水化液
(μL)
Lysis buffer(μL)
90
90
90
90
90
90
90
90
90
G250
5
5
5
5
5
5
5
5
5
读数浓度
(μg/μL)
Reading concentration
(μg/μL)
0.3
0.8
0.6
1.2
0.4
1.2
0.3
0.5
0.8
实际浓度
Real concentration
3
8
6
12
4
12
3
5
8
表
3
等电聚焦程序表
Table 3 Steps of IEF
步骤
Step
电压
Voltage
泳动状态
Condition
时间
Time
S1
50 V
Slow
10 min
S2
250 V
Rapid
30 min
S3
1000 V
Rapid
30 min
S4
9000 V
Line
4 h:15 min
S5
9000 V
Rapid
65000 VH
其他参数：
GELS : 2
；
Limit : 50
；
Temp: 20
℃。
3.2.3
蛋白质
SDS-PAGE
平衡前，按
2
块胶
(17 cm
胶条
)
的量
(150 mL)
配
制
12.5%
的
SDS-PAGE
凝胶液如下：①
ddH
2
O 62.7 mL
；
②
30%
丙烯酰胺溶液
Acr/Bis 83.3 mL
；③
1.5 mol/L
Tris (pH 8.8) 50 mL
；④
10% SDS2 mL
；Ⅰ
10% APS
过硫酸氨
2 mL
；Ⅱ
TEMED 35.6~40 μL
。按顺序加
入试剂①②③④，用玻棒缓慢搅拌混匀
15~30 mim
，
再加入试剂Ⅰ、试剂Ⅱ，缓慢混匀后即可灌胶，用
异丙醇密封胶面。待胶凝固后，倾出异丙醇，改加
ddH
2
O
压平胶面，用保鲜膜覆盖，备用。
平衡时，
17 cm
胶条需平衡液
5 mL /
根
/
次。平
衡液
I
现加
(DTT, 1%
质量体积比
)
，缓慢摇晃平衡
15 min
；平衡液
II
现加
(IAA, 5%
质量体积比
)
，平衡
15 min
。平衡期间，准备蛋白分子量
Marker (
使用前
沸水煮
5 min)
。
将胶条和吸有蛋白分子量
Marker
的滤纸片转
入制备好的
SDS
聚丙烯酰胺凝胶。二向电泳程序，
40 mA
恒流电泳。看到溴酚蓝指示线整齐泳出后，
再将电压调至
30 mA/
根直到电泳结束。
3.2.4
考马斯亮蓝凝胶染色及扫描
电泳结束，需对凝胶中的蛋白质点进行固定，
固定液配方
(2
块胶
:
乙醇
400 mL,
乙酸
100 mL,
ddH
2
O 500 mL,
混匀
(1 000 mL)
，每块胶倒入
500 mL
固定液，固定
3 h
；循环水真空泵吸干固定液换上染
色液。考染法：
2
块胶染液配方：
ddH
2
O 200 mL
，
磷酸
100 mL
，硫酸铵
100 g
，
G250
称取
1.2 g
，
ddH
2
O
定容至
800 mL (
搅拌
30 min
），最后加上甲醇
200 mL
，
总体积
1 000 mL
。染色过夜，直到胶点明晰可辨。
二步法凝胶脱色。
2
块胶脱色液Ⅰ配方：硫酸铵
75 g
用
ddH
2
O
溶解后定容至
1 350 mL
，再加甲醇
150 mL
至总体积
1 500 mL
。其中
1 000 mL
用于第一次脱色
20~30 min
；剩余的
500 mL
脱色液Ⅰ，再加
500 mL
ddH
2
O
，混匀
(1 000 mL)
，即脱色液Ⅱ。第二次，脱
色
(
液Ⅱ
) 12~16 h
，或过夜，直至背景颜色透明而蛋
白点清晰易辨。于
GE Image Scanner
Ⅲ扫描仪上扫
描，分辨率统一设为
300 dpi
。
3.2.5
凝胶图像的
PDQuest 7.4
软件分析
PDQuest
软件读取
2
-
DE
图像，用点细化
(Spot
segmentation)
的方法检测和定量蛋白质斑点，主要
包括
:
斑点检测和定量、凝胶匹配、相对分子量和
等电点的确定、报告输出等。
分子植物育种
F
enzi Zhiwu Yuzhong