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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1069
and 7 introns. The sequences of
rCSD1-2
and
gCSD1-2
in the 4 cultivars were completely identical, while 99.68% and 99.70%
homologous as to
rCSD1-1
and
gCSD1-2
, respectively. The 6 SNP in the coding region of the 4 varieties caused the number 53, 75,
and 147 differences of the corresponding amino acid sequences. Alignment showed
gShCSD1-2
was 100% identical with
gAipCSD1
from
A.ipaensis
and
gShCSD1-1
was 99.89% and 99.48% identical with
gAduCSD1
and
gAkuCSD1
from
A.duranensis
and
A.kuhlmannii
, respectively. Molecular evolutionary analysis displayed
gCSD1-1
and
gCSD1-2
came respectively from A- and B-
genome of cultivated peanut, and
A.ipaensis
was the donor of B- genome. Compared with
A.kuhlmannii
,
A.duranensis
had a closer
relationship with peanut cultivars. The present study provided important basis for exploring the correlation between gene structure
and transcriptional level of
AhCSD1
and drought tolerance, and also for revealing the molecular mechanism of drought resistance in
different peanut varieties.
Keywords
Peanut; Cu/Zn-SOD gene; Sequence analysis; Drought resistance
研究背景
植物正常生长时活性氧
(reactive oxygen species,
ROS)
的产生和清除处于动态平衡状态，但在高温、
干旱、盐渍以及病虫害等逆境条件下，
ROS
过度
积累引起细胞膜脂过氧化反应，进而导致
DNA
、
蛋白质及其它细胞组分损伤，严重时致使植物死亡
(Apel and Hirt, 2004)
。在长期进化过程中，植物形
成了由超氧化物歧化酶
(SOD)
、过氧化氢酶
(CAT)
等组成的酶促抗氧化防护系统，对清除胁迫条件下
积累的
ROS
，减轻或避免
ROS
对细胞的伤害起到
重要作用
(
尹永强等
, 2007)
。
SOD (Superoxide Dismutase, EC 1.15.1.1)
作为
抵御活性氧介导的氧化损伤的第一道防线，是保护
酶体系中的关键酶。在高等植物中
SOD
可根据其
辅基部位结合的不同金属离子主要分为
Mn-SOD
、
Fe-SOD
和
Cu/Zn-SOD
三类，其中
Cu/Zn-SOD
主要
位于细胞质和叶绿体
(Huang et al., 2012)
。花生
SOD
同工酶有
Cu/Zn-SOD
和
Mn-SOD
两种，且
Cu/Zn-SOD
活性更稳定，在遭遇环境剧烈变化时能
够快速提高酶活性以保护植物免受
ROS
伤害，是
花生
SOD
活性的最主要组成部分
(
武宝玕
, 1989)
。
目前，
Cu/Zn-SOD
相关基因已从多种植物得到分离
克隆和表达分析，并应用于提高植物的抗逆性。
SOD
活性是花生重要的抗旱性成分
(
王小纯等
,
2002;
姜慧芳和任小平
, 2004)
，不同花生品种应对
干旱胁迫时
SOD
活性变化差异显著
(
张智猛等
,
2013)
。以往研究多集中于干旱胁迫下
SOD
活性变
化分析，而对其相关基因水平的研究报道较少。本
研究以花生
Cu/Zn-SOD
基因
cDNA
序列
(GenBank:
DQ097721)
为基础，从花生栽培品种与二倍体野生
种
A.duranensis
、
A.kuhlmannii
和
A.ipaensis
中克隆
细胞质
Cu/Zn-SOD
基因
(
AhCSD1
)
，分析其分子生
物学特征，明确该基因分子起源，为进一步探究
AhCSD1
基因响应干旱胁迫以及不同品种间
SOD
活
性差异的分子机理提供依据。
1
结果与分析
1.1
花生
AhCSD1
的克隆
对参考序列
(DQ097721)
分析表明，该
cDNA
序
列与拟南芥细胞质
Cu/Zn-SOD
基因
(
CSD1
)
编码区同
源性达
78%
，推导的氨基酸序列同源性高达
81.6%
，
无明显跨膜结构与信号肽，且活性位点高度保守，
故确定该序列为花生细胞质
Cu/Zn-SOD
基因
cDNA
序列。通过搜索花生
EST
数据库将该序列向
3'
端延
伸，在终止密码子下游具有
poly(A)
加尾信号。
以栽培品种山花
9
号、
ICG6848
、农大
818
和
荔浦大花生
cDNA
为模板，用引物
CSD1-F: GCTT
CTTTCCCTTCTCAGTCAA
和
CSD1-R: CACGCGA
AAAAGCATGATAATC
进行
PCR
扩增，产物经电
泳检测获得
550 bp
左右特异性条带，与预期大小相
符
(
图
1A)
；
4
个品种扩增产物回收后经测序均获得
2
个
AhCSD1
基因，分别命名
(
表
1)
。以栽培品种和
二倍体野生种基因组
DNA
为模板，引物
CSD1-F/R
进行
PCR
扩增，电泳结果显示特异性条带长度约
图
1
花生
AhCSD1
基因
PCR
扩增电泳结果
注
: A:
以
cDNA
为模板扩增结果
; B:
以
DNA
为模板扩增结
果
; M: DL2000 marker
Figure 1 Agarose gel electrophoresis pattern of
AhCSD1
amplification in
Arachis
Note: A: Amplification using cDNA template; B: Amplification
using DNA template; M: DL2000 marker