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张秀荣等
:
花生
Cu/Zn-SOD
基因
(
AhCSD1
)
克隆及品种间等位多态性分析
1070
2 100 bp (
图
1B)
；测序结果表明栽培种分别获得两
条同源序列，分别命名
(
表
1)
。野生种
A.duranensis
、
A.kuhlmannii
和
A.ipaensis
各获得一条序列，分别命
名为
gAduCSD1
、
gAkuCSD1
和
gAipCSD1
。
1.2
山花
9
号
AhCSD1
序列分析
1.2.1 cDNA
序列分析
由山花
9
号获得的
rShCSD1-1
和
rShCSD1-2
长度均为
550 bp
，最大开放阅读框
(open reading
frame, ORF)
位于
51~509 bp
，编码
152
个氨基酸
残基
(aa)
；两条序列同源性为
98.18%
，共存在
10
个变异位点，且均位于编码区，其中
7
个为单核
苷酸多态性
(single nucleotide polymorphism, SNP)
位点，
A-G
、
T-C
转换和
A-C
颠换位点数分别是
2
个、
4
个和
1
个；与参考序列同源性分别为
98.00%
和
99.82%
；
ATG
起始密码子附近符合
Kozak
规则
(AXXATGG)(
图
2)
。
1.2.2 DNA
序列分析
由山花
9
号获得的两条
DNA
序列
gShCSD1-1
和
gShCSD1-2
长度分别为
2 169 bp
和
2 185 bp
，序
列同源性
97.08%
；全序列共存在
64
个差异位点，
其中有
27
个
SNP
，占总变异位点的
42.19%
，转换、
颠换、缺失位点数分别为
14
个、
12
个和
1
个
(
图
2)
。
Splign
分析表明两条序列均含有
8
个外显子和
7
个内含子，
rShCSD1-1
和
rShCSD1-2
分别与
gShCSD1-1
和
gShCSD1-2
外显子部分一致
(
图
2)
，
外显子平均长度均为
68 bp
；内含子平均长度分别
为
232 bp
和
234 bp
，内含子Ⅰ最大，长度均为
470 bp
，
内含子Ⅱ最小，长度均为
105 bp
；两序列在内含子
Ⅵ和Ⅶ区域多态性位点丰富，除
16
个
SNP
外，分
别具有短序列缺失；所有内含子的剪切方式均符合
GT/AG
规则
(
图
2)
。
限制性酶切位点分析发现
gShCSD1-1
特有
Xmn
Ⅰ
的识别位点，
gShCSD1-2
特有
Bam
H
Ⅰ
和
Spe
Ⅰ
两种限制性酶的识别位点
(
图
3)
；且两条序列间
差异引起了
Aha
Ⅲ
(TTT/AAA)
、
Bcl
Ⅰ
(T/GATCA)
、
Bsi
Ⅰ
(C/TCGTG)
、
Dra
Ⅰ
(TTT/AAA)
、
Nsi
Ⅰ
(ATGCA/T)
和
Ssp
Ⅰ
(AAT/ATT)
六种限制性酶识别
位点数目变化。
1.2.3
推导的氨基酸序列分析
由
rShCSD1-1
和
rShCSD1-2
推导的氨基酸序
列，分别命名为
ShCSD1-1
和
ShCSD1-2
，长度均为
152 aa
，富含甘氨酸
(Gly)
，分别占氨基酸组成的
17.8%
和
18.4%
；两条序列同源性
97.37%
，存在
4
个氨基酸差异
(
图
4)
，与参考序列推导的氨基酸序列
同源性分别为
96.71%
和
99.34%
。
生物信息学预测结果显示
ShCSD1-1
和
ShCSD1-2
理论分子量
(MW)
和等电点
(pI)
分别为
15.1 kDa
、
5.67
和
15.2 kDa
、
5.46
。
ShCSD1-1
二级
结构含
α
螺旋
3.29%
，延伸串
34.21%
，
β
转角
9.21%
，不规则卷曲
53.29%
；
ShCSD1-2
含
α
螺旋
5.26%
，延伸串
33.55%
，
β
转角
10.53%
，不规则
卷曲
50.66%
；两条序列均无明显跨膜结构，为非
分泌蛋白；亚细胞定位预测表明
ShCSD1-1
和
ShCSD1-2
均最可能定位于细胞质，总体分值分别
为
8.7
和
8.1
。
表
1
供试花生栽培品种及
AhCSD1
基因
cDNA
、氨基酸序列命名
Table 1 Tested peanut cultivars and the corresponding cDNA and amino acid sequence label of
AhCSD1
亚种
Subspecies
类型
Type
品种名
Accession
cDNA
序列名
cDNA sequence label
DNA
序列名
DNA sequence label
氨基酸序列名
Amino acid sequence label
疏枝亚种
spp.
fastigiata
中间型
irregular type
山花
9
号
Shanhua 9
rShCSD1-1
,
-2
gShCSD1-1
,
-2
ShCSD1-1, -2
多粒型
var.
fastigiata
ICG6848
rIgCSD1-1
,
-2
gIgCSD1-1
,
-2
IgCSD1-1, -2
密枝亚种
spp.
hypogaea
普通型
var.
hypogaea
农大
818
Nongda 818
rNdCSD1-1
,
-2
gNdCSD1-1
,
-2
NdCSD1-1, -2
龙生型
var.
hirsuta
荔浦大花生
Lipudahuasheng
rLpCSD1-1
,
-2
gLpCSD1-1
,
-2
LpCSD1-1, -2