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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1028
质，再将细胞悬液放室温静置
20~30 min
，目的是
细胞沉降而细胞碎片留在上清液中，去上清液保留
下层溶液进行滴片，此法细胞收率高。此外，滴片
法还应当严格控制酶解时间和后低渗时间，当材料
或组织块较大质地较硬时，时间要长一些，反之相
反。滴片高度一般在
30~100 cm
，玻片水平倾角约
30
℃，尽量将细胞悬液滴在玻片非标签端的中下
部，便于后续的杂交洗脱。
2.2
防止染色体掉片的方法
由于实验过程要对杂交区域进行洗脱，经常会
出现染色体从载玻片上脱落的现象，在制片时使用
多聚赖氨酸处理的防脱载玻片可以增加染色体的
吸附力；滴片后过酒精灯火焰，既可以蒸发掉部分
固定液，也能使染色体更好地贴附在玻片上。实验
用胃蛋白酶处理玻片标本，目的是消化细胞质中的
蛋白质，使探针和试剂更易进入染色体，获得较均
匀的杂交信号并在一定程度上减少背景的产生，但
胃蛋白酶酶解过度或时间过长会造成染色体形态
不完整（如染色体边缘弥散、染色体断裂等），也
容易造成染色体掉片。如果染色体制片质量较高，
实验过程中就可以省略胃蛋白酶酶解这一步骤
(
林
小虎等
, 2005)
。另外，
60
℃烘箱烤片及染色体高温
变性前对玻片的预热也可以使染色体与载玻片结
合得更牢固，防止染色体掉片。在实验过程中严格
控制实验温度
(37
℃
~42
℃为宜
)
，洗脱的时间不宜过
长，以及在整个实验过程中应保持
pH
的稳定等，
也可以减少染色体掉片发生的频率。
2.3
原位杂交探针的长度和浓度
由于植物的基因组很大，不能直接用于探针标
记，标记前需将其剪切打断成较小片段，以提高杂交
效率。对于延展的染色体，探针长度可超过
1 000 bp
。
小片段探针较大片段探针杂交速率快，特异性强，
但
15~30 bp
的寡核苷酸探针带有的标记物少灵敏度
较低。基因组
DNA
的剪切打断方法主要有煮沸法、
超声波清洗仪剪切、移液枪反复吸打及高压灭菌打
断法等，由于不同种的
DNA
含
G
、
C
量不同，这
使不同物种的
DNA
在降解到一定长度所需的时间
存在差异
(
李璇等
, 2002;
顾爱侠等
, 2010
)
。本研究
采用的是高压灭菌打断法，亲本基因组
DNA
以
121
℃高温灭菌
10 min
后，得到的片段多数为
300~500 bp
，适宜用作基因组荧光原位杂交探
针。国内制备的荧光原位杂交探针浓度主要在
0.5~5.0 μg/mL
之间，在一定的范围内，增加探针
浓度，可以增加杂交率和杂交敏感性，但过多的探
针可能造成较大的“噪音”干扰。探针的任何内在
物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记
物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
2.4 GISH
技术在甘蔗育种中的作用
栽培甘蔗属于异源多倍体植物，要想对其染色
体来源与遗传特性深入研究，
GISH
无疑是一种特
别有效的方法
(D’Hont et al., 1996; Cuadrado et al.,
2004; Piperidis et al., 2010a)
，同时，
GISH
技术也被
广泛地应用于甘蔗远缘杂交后代染色体鉴定研究
(D’Hont, 2005; Piperidis et al., 2010b; Wang et al.,
2010)
。应用单色
GISH
时，封阻
DNA
与探针用量
比例相对要高些，才能鉴定
F
1
代材料野生种外源染
色体，用于染色体遗传组成的粗略分析，单色
GISH
的研究成本相对较低；当对杂交
F
1
花粉母细胞减数
分裂染色体遗传行为研究、
F
2
以后及更高世代的染
色体分析时，用双色或多色
GISH
会得到更精确的
结果。本研究对进一步分析高世代材料中含滇蔗茅
野生种外源染色体及其遗传行为奠定了实验基础。
3
材料与方法
3.1
材料
实验用材料包括甘蔗属热带种、野生种滇蔗茅
及其远缘杂交后代材料，均栽种在云南省农业科学
院甘蔗研究所甘蔗杂交亲本圃中。
3.2
染色体玻片标本的制备
F
1
代根尖样品用对二氯苯水饱和溶液与
0.002 mol/L 8-
羟基喹啉等体积混合液，于室温预处
理
4 h
，双蒸水洗
2
次
10 min
，用
0.075 mol/L KCl
于室温低渗
1 h
，双蒸水洗
2
次
10 min
，卡诺氏固
定液
I (
无水乙醇
:
乙酸
=3:1,
现配现用
)
，于
4
℃冰箱
固定
24 h
，双蒸水洗
2
次
10 min
，根尖材料浸泡在
70%
乙醇溶液中，
4
℃冰箱保存备用。制片方法详见
(
尤瑞麟
, 2008,
北京大学出版社
, 159-160)
，略有修
改。取出
2
条根尖，双蒸水洗
2
次
10 min
，置于洁
净的凹面载玻片上，将根尖表皮和根冠去掉，剥下
分生区组织，
0.25 N HCl
解离
3-6 min
，转入
500 μL
离心管中，加
150 μL
酶液
(2%
纤维素酶
+0.5%
离析
酶
)
于
37
℃恒温水浴锅处理
45 min (
期间轻轻摇几
次
)
。水洗
2
次
10 min
，用双蒸水后低渗
1-2 h
，加
100 μL
现配的卡诺氏固定液Ⅰ将酶解好的组织块
捣碎，静置片刻去沉淀和静置
20~30 min
去上清，
用移液枪滴片，滴片前将载玻片置
-20
℃冰箱预冷
10 min
，左右各滴一滴，过酒精灯火焰，使载玻片