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林秀琴等
:
应用
GISH
技术鉴定甘蔗野生种外源染色体
1029
上出现小雨点现象即可，室温自然晾干，或
-20
℃冰
箱保存备用。
3.3
叶片基因组总
DNA
的提取、
DNA
探针的标记
采用
CTAB
法提取双亲本基因组总
DNA
及玉
米叶片基因组总
DNA(
封阻用
)
，参照范源洪等
(1999)
和王英等
(2008)
的方法略有修改，用百泰克多功能
DNA
回收纯化试剂盒对
DNA
样品进行纯化和回
收。采用高压灭菌法
(121
℃
, 10 min)
将基因组
DNA
打断成较小的片段，
1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
片段的大小。双亲本
DNA
模板分别用德国
Roche
公司产品
DIG-High Prime
和
Biotin-High Prime
进行
标记，具体方法见说明书。
3.4
原位杂交过程
配制
40 μL
杂交混合液
(
含
50%
去离子甲酰胺
,
10% DS, 0.5% SDS, 6 ng/μL
探针及适量封阻
DNA)
，涡流混合器上混匀，于
PCR
仪上
97
℃变性
10 min
，迅速取出，置冰水盒中冷却
10 min
待用。
染色体玻片标本用
60
℃烘箱烤片干燥
5 h
，每片加
70%
去离子甲酰胺
100 µL
，加封口膜盖片后于
77
℃
水浴锅变性
7 min
，揭去膜。过
-20
℃
70%
、
95%
、
100%
梯度酒精脱水，
5 min/
级。从
-20
℃
100%
酒精
中取出染色体玻片标本，迅速甩干玻片上的酒精，
将变性的杂交混合液滴在变性的染色体玻片标本
上，盖上封口膜，放在一密闭湿盒中，置于
37
℃恒
温水浴锅中杂交过夜。用
0.1% SDS (2×SSC)
漂去盖
片，
0.1% SDS (0.2×SSC)
洗
3
次
5 min
，
5% BSA
，
37
℃处理
30 min (
封阻内源性生物素蛋白产生的干
扰
)
，加荧光抗体工作液
(25 μg/mL Bio-Avidin-FITC
与
15 μg/mLAnti-DIG-Rhodamin
均等混合液
,
避光
)
进行检测，
37
℃，温育
1 h
，用
1×PBS/Teween 20 37
℃
漂洗
3
次
5 min
，
DAPI
衬染
7 min (
避光
)
，
1×PBS
室温漂洗
3
次
3 min
。用
Vectashied
抗荧光衰减剂封
片后，在德国
Ziess
公司荧光显微镜下观察，用
Metasystem ISIS
系统对细胞荧光图像进行拍照和
处理。
3.5
核型分析
用
Metasystem Isis
软件进行染色体核型分析，
核型分析参照李懋学和陈瑞阳
(1985)
的标准。
作者贡献
林秀琴、陆鑫、苏火生和刘洪博是本研究的实验设计
和实验研究的执行人；蔡青是项目的构思者和负责人，指导
实验设计，论文写作与修改；刘新龙参与实验设计及论文写
作修改；毛钧参实验结果分析和论文写作。全体作者都阅读
并同意最终的文本。
致谢
本研究在中国科学院昆明植物研究所完成，感谢顾
志建研究员在染色体制片及原位杂交探针制备方面给予
的宝贵意见，还要感谢杨静博士在基因组荧光原位杂交实
验过程中给予的帮助和指导。
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