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分子植物育种(网络版)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
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0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U)，结果显示：酶浓度在
0.75 U、 1.0 U时扩增条带较多，用量为1.25 U时，
产物条带出现扩散，综合考虑，ExTaq 酶浓度确定
为0.75 U，如图6 中3泳道。
图5不同引物浓度的SRAP 反应结果
注: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.4 μmol/L, 0.6 μmol/L,
0.8 μmol/L,1 μmol/L, 1.2 μmol/L, 1.4 μmol/L
Figure 5 The SRAP profile with different primer concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.4 μmol/L, 0.6 μmol/L,
0.8 μmol/L, 1 μmol/L, 1.2 μmol/L, 1.4 μmol/L, respectively
图6不同Extaq酶浓度的SRAP 反应结果
注: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.25 U, 0.5 U, 0.75 U, 1.0 U,
1.25 U, 1.5 U
Figure 6 The SRAP profile with different Extaq DNA
polymorases concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.25 U, 0.5 U, 0.75 U,
1.0 U, 1.25 U, 1.5 U, respectively
1.2.6退火温度对PCR扩增效果的影响
退火温度是影响PCR特异性的重要因素，根据
引物的长短、碱基和浓度而定。较低的退火温度可
以使引物与模板发生结合，但易产生非特异性条
带；过高又抑制引物与模板的结合。试验在PCR仪
自动生成的温度梯度中选择 6个温度扩增 (48.1℃ ,
49.4℃ , 50.7℃ , 52.6℃ , 54.1℃ , 55.5℃) ，结果表明：
温度为48℃或高于55℃时，PCR产物量较低，条带
亮度弱，而在50℃和52℃温度时扩增稳定。因此，
确定退火温度为50℃如图7中 3泳道。
1.3优化反应体系的验证
使用初步筛选的引物组合 Me11/Em5，对 16 份
不同种源的国槐进行扩增，验证上述优化体系，结
果显示( 图 8)，每份样品均扩增出 DNA 片段，条带
清晰，说明该体系稳定，适合国槐 SRAP-PCR 反应。
图7 不同退火温度SRAP反应结果
注: M: DNA marker DL15000; 1~6: 48.1℃, 49.4℃, 50.7℃,
52.6℃, 54.1℃, 55.5 ℃
Figure 7 The SRAP profile with different annealing temperature
concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 48.1℃, 49.4 ℃, 50.7℃,
52.6℃, 54.1℃, 55.5 ℃, respectively
图8 引物ME11-EM5 对国槐16个样品的SRAP扩增电泳结果
Figure 8 SRAP profiles amplified among 16 grape cultivars
with primer pair M11-E5
2结论与讨论
SRAP 被成功应用于多种植物的遗传多样性分
析、相关基因克隆、遗传图谱构建以及重要的性状
标记等，如红松(Chen et al., 2010)、柿树(Guo and
Luo, 2006)甜瓜(王建设等, 2007)等，基于 PCR 反应
的 SRAP 标记，反应体系中任何一种因素的改变
都会影响扩增结果的变化，各组分间相互作用的
浓度较难确定。本实验采用单因素完全设计和正
交实验设计相结合的方法，共同探讨了国槐
SRAP-PCR 中各影响因子的规律及最佳浓度范围，
正交实验结果显示以 9 泳道最佳( 图 1)，其主要反应
因素浓度为：Mg2+ 1.5 mmol/L，DNA80 ng ，dNTPs
2.5 mmol/L ，引物 0.8 μmol/L，ExTaqDNA 1.0 U，
单因子实验结果显示：Mg2+ 1.5 mmol/L，DNA 80 ng，
dNTPs 2.5 mmol/L，引物 0.8 μmol/L，ExTaqDNA
0.75 U。这两种实验结果都表明 DNA 80 ng，dNTPs
2.5 mmol/L 时最佳。通过多次多水平实验证明，