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宋伟栓等
:
国槐
SRAP-PCR
反应体系的建立与优化
1021
1.2
单因子试验结果分析
1.2.1 Mg
2+
浓度对
PCR
扩增效果的影响
Mg
2+
浓度较高时可以增加产量，但也会降低反
应的忠实性，还会影响
ExTaqDNA
聚合酶的活性，直
接影响产量
(
陈万胜等
, 2008;
王燕青和季孔庶
,
2009)
。
Mg
2 +
能与反应液中的引物、模板及
dNTPs
相
结合，使引物与模板的结合效率受到影响，还影响
产物特异性及形成引物二聚体等
(
孟宪婷等
, 2009)
，
试验选取了
(0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1.0 mmol/L,
1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L)
浓度的
Mg
2+
进
行了
PCR
扩增，结果显示：
Mg
2+
为
2.0 mmol/L
时扩
增条带清晰，且出现了特异性条带，当浓度过高时，
谱带又变弱，最终确定
Mg
2 +
浓度为
2.0 mmol/L
，如
图
2
中
5
泳道。
图
2
不同
Mg
2+
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L,
1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L
Figure 2 The SRAP profile with different Mg
2+
concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L,
1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L, respectively
1.2.2 DNA
浓度对
PCR
扩增效果的影响
DNA
模板的浓度和质量，是
PCR
成败的关键因
素之一，太少时没有扩增条带，太多时则会出现非
特异性条带（彭飒等
, 2006,
第二军医大学学报，
27(5): 544-547
）。试验选用不同
DNA
模板浓度
(40 ng,
60 ng, 80 ng, 100 ng, 120 ng, 140 ng)
进行扩增，结果
显示：
DNA
模版在
80~120 ng
之间没有明显的差异，
考虑经济因素，确定
80 ng
模板量为宜，如图
3
中
3
泳道。
1.2.3
dNTPs
浓度对
PCR
扩增效果的影响
dNTPs
与扩增效率密切相关，过高时与
ExTaqDNA
酶竞争
Mg
2+
，过低时会使扩增产物单链
化，两者都对扩增不利
(
孟宪婷等
, 2009)
。试验选取
(1 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L,
3.0 mmol/L, 3.5 mmol/L)
的
dNTPs
浓度进行扩增，结
果显示：
1.5 mmol/L
、
0.20 mmol/L
浓度时效果较好，
综合考虑，确定
dNTPs
最适浓度为
2.0 mmol/L
，如
图
4
中
3
泳道。
图
3
不同
DNA
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA marker DL15000; 1~6: 40
ng
, 60
ng
, 80
ng
, 100
ng
,
120
ng
, 140 ng
Figure 3 The SRAP profile with different DNA concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 40 ng, 60 ng, 80 ng, 100 ng,
40 ng,120 ng, respectively
图
4
不同
dNTPs
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA marker DL15000; 1~6: 1 mmol/L,1.5 mmol/L,
2 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3 mmol/L, 3.5 mmol/L
Figure 4 The SRAP profile with different dNTPs concentrations
Note: M: DNA marker DL15000; 1~6: 1 mmol/L, 1.5 mmol/L,
2 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3 mmol/L, 3.5 mmol/L, respectively
1.2.4
引物浓度对
PCR
扩增效果的影响
引物浓度能够影响扩增特异性，过高会加剧非
特异性扩增和错配的发生；引物浓度过低会使
PCR
扩增效率降低
(
任羽等
, 2004)
，所以选择合适的引
物浓度很重要。试验选取
(0.4 μmol/L, 0.6 μmol/L,
0.8 μmol/L, 1 μmol/L, 1.2 μmol/L, 1.4 μmol/L)
的引
物浓度，研究结果显示：伴随引物浓度不断加
大，扩增的条带变得逐渐清晰、丰富，过高时
条带又变弱，在
0.6 μmol/L
时出现特异性条带，
在
0.6
-
0.8 μmol/L
之间没有差异，最终确定引物浓
度为
0.6 μmol/L
，如图
5
中
2
泳道。
1.2.5 ExTaq
酶浓度对
PCR
扩增效果的影响
酶用量是
PCR
重要影响因素之一，
ExTaqDNA
聚合酶浓度过低时无扩增，浓度过高又会引起非特
异性扩增。实验设置
6
个
ExTaq
酶浓度
(0.25 U, 0.5 U,