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宋伟栓等
:
国槐
SRAP-PCR
反应体系的建立与优化
1023
Mg
2+
浓度
2.0 mmol/L
，引物
0.6 μmol/L
，
ExTaqDNA
聚合酶
0.75 U
时，此反应体系扩增条带更清晰，重
复性和稳定性较好，所以，最终建立的
SRAP
体系
(20 μL)
为：
Mg
2+
浓度
2.0 mmol/L
，模板
DNA 80 ng
，
dNTPs 2.5 mmol/L
，引物
0.6 μmol/L
，
ExTaqDNA
聚合酶
1.0 U
，
10×PCR Buffer 2.5 mmol/L
；退火温
度为
50
℃时最佳。利用该体系进一步进行国槐遗传
多样性分析，对不同地理种源的国槐进行遗传分化
度和亲缘关系的研究，为国槐分子辅助育种，种质
资源的保存和利用提供一定的理论基础。
3
材料与方法
3.1
材料与试剂
供试材料分别来自山东潍坊、淄博、滨州、泰
安、东营等地的野生古国槐资源，由
2012
年
3
根据
山东省古树索引资料，搜集到古国槐无性系，嫁接
于山东省林业科学研究院苗圃基地。整个实验以古
国槐无性系叶片为材料。
试验所用
ExTaqDNA
聚合酶，
Mg
2
＋
，
10×PCR
Buffer
，
dNTPs
等试剂均购自大连
TaKaRa
公司；
SRAP
引物采用的组合参考文献
(Li and Qurios, 2001;
Ferriol et al., 2003)
，由上海博尚生物工程技术有限
公司合成。
3.2
实验方法
3.2.1 DNA
提取与检测
采用改良
CTAB
法提取样品材料中的
DNA
(Fjellstrom et al., 1994)
。用
0.8%
的琼脂糖凝胶电泳
对提取样品
DNA
进行初步检测后，在紫外分光光
度计下对其浓度和纯度进行定量检测，并将
DNA
稀释到约
50 ng/μL
，于-
20
℃条件下保存。
3.2.2 PCR
反应程序的确定
参考文献
(Li and Qurios, 2001)
的扩增程序：
94
℃
预变性
5 min
；
94
℃变性
1 min
-
35
℃退火
1 min
-
72
℃
延伸
1 min
，
5
个循环；
94
℃变性
1 min
-
50
℃退
火
1 min
-
72
℃延伸
1 min
，进行
35
个循环；最后
72
℃
延伸
10 min
，
4
℃保存。
3.2.3 PCR
反应因素水平的确定
为了确立
SRAP
反应体系
(20 μL)
中主要因素：
ExTaq
酶、引物、
DNA
模版、
Mg
2+
和
dNTPs
。的最
佳水平，该实验采用
L
16
(4
5
)
正交设计和单因子设计
相结合的方法，各因素水平见表
2
。引物对序列为
ME11
：
TGAGTCCAAACCGGATA
，
EM5
：
TGAGTC
CTTTCCGGTAA
。
表
2 SRAP-PCR
反应因素水平
Table 2 factors levels of PCR reaction
水平
Level
因素
Factor
EXTaq
酶
(U)
ExTaq polymerase (U)
Mg
2 +
(mmol/L)
DNA/ng
dNTPs (mmol/L)
引物
(mmol
/
L)
Primer (mmol
/
L)
1
0.1
1.5
40
1.0
0.6
2
0.15
2.0
60
1.5
0.8
3
0.20
2.0
80
2.0
1.0
4
0.25
3.0
100
2.5
1.2
3.2.4 SRAP
优化体系的验证
利用优化好的
SRAP
体系，多不同国槐样品
进行扩增，引物组合同上
(3.2.3)
，
PCR
产物用含
EB 0.5 mg/L
琼脂糖凝胶
(1.5%)
电泳检测紫外光下
GeneGenius
观察成像。
作者贡献
宋伟栓是本研究的实验设计和实验研究的执行人；庞彩
红、李双云及李丽完成数据分析；杨克强参与实验设计，试
验结果分析；夏阳是项目的构思者及负责人，指导实验设计，
数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的
文本。
致谢
本研究由山东省农业生物资源创新利用研究课题
(2001157)
资助。
参考文献
Chen L.L., Zou X.Y., Li S.Y., Zou X.F., Zhang J.M., and Song
L.Q., 2008, Analysis the diversity of rapeseed by SSR and
SRAP with emphasis on the diference ofthis two kinds of
markers, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding),
6(3): 5l1-516 (
陈伦林
,
邹小云
,
李书宇
,
邹晓芬
,
张建
模
,
宋来强
, 2008, SSR
和
SRAP
标记揭示甘蓝型油菜遗
传多样性的差异分析
,
分子植物育种
, 6(3): 511-516)