Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1020
的集材用、药用、食用、观赏于一体的树种，在园
林绿化中占有重要地位
(
火树华
, 1990,
中国林业出
版社
, 221-224)
。目前，有关国槐繁殖技术
(
袁秀云等
,
2007)
和遗传转化方面的研究比较多
(
张晓英等
,
2009)
，国槐种子不同性状的表型变异及规律研究也
有报道
(
孙荣喜
, 2011)
，但是，国槐分子技术应用上
比较薄弱，因此，开展新型标记研究古国槐遗传多
样性，为国槐遗传资源评价、保存和利用提供依据，
对促进古国槐分子育种进程具有重要意义。
相关序列扩增多态性
(sequence-related amplified
polymorphism, SRAP)
是新型的
PCR
分子标记技术，
于
2001
年由美国加州大学蔬菜作物系
Li
与
Quiros
博
士在芸苔属植物上开发而来
(Li and Qurios, 2001)
，该
标记多态性高、重复性好、在基因组中分布均匀、
引物通用性强等
(
柳李旺等
, 2004,
南京农业大学学
报
, 26(5): 777-781)
；
SRAP
正反相引物可以两两随机
搭配组对，用少数引物得到多对引物组合，这样使
得引物的使用效率提高了，引物的合成成本也降低
了。目前该标记已被成功应用于遗传图谱构建
(
林忠
旭等
, 2003,
科学通报
, 48(15): 1676-1679
）
、
杂种纯度
鉴定
(
文雁成等
, 2006
）、遗传多样性分析
(
陈伦林等
,
2008
）等方面研究工作。
利用
SRAP
分子标记进行遗传多样性分析
时，
PCR
体系非常重要，何正文等
(1998)
较早提
出了正交设计优化
PCR
体系的方法，该方法综合
考查了
PCR
反应体系中各因素及其互作影响，较
快得到理想的试验结果，提高效率。本实验采用
L
16
(4
5
)
正交设计和单因子相结合的试验，从
Mg
2 +
浓度、
DNA
模板浓度、
dNTPs
浓度、引物浓度、
Ex
Taq
酶浓度以及退火温度等几个方面进行国槐
SRAP-PCR
主要反应条件的探讨，最后确立最优
反应系统，为今后进行古国槐遗传多样性分析及
育种工作奠定良好的基础。
1
结果与分析
1.1 SRAP-PCR
正交实验结果分析
国槐
L
16
(4
5
)
正交因素水平反应见表
2
，电泳实验
结果如图
1
。根据遗传多样性分析要求
,
对
PCR
扩增
结果依据电泳谱带的强弱及多少，从高到低依次打
分，将
16
个处理结果划分为
16
个评分等级以便统计
分析
(
何正文等
, 1998)
。这种打分的方法，主观性比
较强，为了使结果更客观，我们根据扩增条带数量
丰富、清晰度高、背景低、特异性条带和非特异性
条带之间的差异明显的处理，同时参考条带亮度和
背景清晰程度为每个处理赋值，进行数据分析。实
验重复两次，
16
个处理赋值数分别为
1, 5, 10, 7, 8, 4,
9, 3, 16, 11, 15, 12, 14, 13, 2, 6
和
3, 5, 8, 9, 12, 11, 13,
2, 16, 15, 14, 10, 6, 7, 1, 4
。将上述两次
16
个处理的
评分结果用
SPSSV18.0
进行方差分析，分析结果见
表
1
。
F
值反映了各因素对
PCR
体系显著性影响情
况，影响随
F
值的增大而增大，反之越小，由表
1
知，
正交设计各因素反应水平对反应体系的影响为
ExTaq
酶
>
引物
>DNA
模版
>Mg
2+
>dNTPs
。
图
1 SRAP-PCR
正交实验设计
PCR
电泳
注
: M: DNA marker DL15000; 1~16:
正交设计
16
个处理
Figure 1 Electrophoresis result of SRAP-PCR by orthoronal
design
Note: M: DNA marker DL15000; l~16: 16 treatments of
orthoronal tests
表
1 SRAP-PCR
反应各因素间方差分析表
Table 1 Variance analysis for the factors of SRAP-PCR reaction
变异来源
Resource
平方和
SS
自由度
DF
方差
MS
F
F
0.01
(3,15)
ExTaq
酶
ExTaq polymerase
146.375
3
48.792
41.821**
5.42
Mg
2 +
19.625
3
6.542
5.607**
DNA
35.875
3
11.958
10.250**
引物
Primer
79.625
3
26.542
22.750**
dNTPs
3.5
3
1.167
0.050
误差
Error
3.5
3
总计
Total
285.00
15
注
: **
在
0.01
水平差异显著
Note
：
**Means significant difference at the 0.01