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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1015
lanatus
)
，起源于非洲南部。
PI296341-FR
是目前世
界上唯一高抗西瓜枯萎病
3
个生理小种的种质，是
西瓜抗病机制研究和抗病育种的理想材料
(
许勇等
,
2000)
。此外，
PI296341-FR
果实糖含量极低
(~1
Brix)
，与普通栽培西瓜
(
Citrullus lanatus
subsp
.
vulgaris
)
果实含糖量
(~11 Brix)
存在巨大差异，因此
也是研究西瓜果实糖代谢和积累机理的理想材料。
栽培西瓜果实
RNA
提取一般采取
SDS
水饱和酚法
(Guo et al., 2011)
，该法能很好的去除果实中的糖分
和蛋白，得到完整性好和条带清晰的总
RNA
，其
28S
和
18S
比接近
2:1
，能满足后续分子生物学实验
的要求。然而，
PI296341-FR
果实富含有果胶、纤
维素等多糖物质，采用该提取方法提取
PI296341-FR
果实总
RNA
时，不仅提取出的
RNA
量很少，而且
提取出的总
RNA
完全降解，无法用于后续分子生
物学实验。寻找一种能有效地提取野生西瓜果实总
RNA
的方法是开展后续分子生物学研究的必要前
提，但目前未见相关报道。
PI296341-FR
果实总
RNA
提取的关键是如何
有效去除果胶及纤维素等多糖物质的干扰。目前植
物
RNA
提取方法中去除多糖干扰的手段主要有以
下三种。第一种，采用
SDS-
盐酸胍方法在高浓度
Na+
或
K+
离子环境中改变多糖的溶解特性，使多糖
类物质能够主要分配到有机相中，随后通过苯酚和
氯仿抽提去掉大部分的多糖
(Su and Gibor, 1988)
。
第二种，多糖或
RNA
的选择性沉淀。利用低浓度
乙醇
(10%~30%)
将多糖沉淀，随后
RNA
经过苯酚
和氯仿抽提后用
75%
乙醇沉淀
(
肖洁凝等
, 2003)
；利
用醋酸钾溶液选择性沉淀多糖
(Bahloul and Burkard,
1993; Ainsworth, 1994; Hughes and Galau, 1988)
；低
浓度乙醇和醋酸钾溶液共同作用沉淀多糖
(Fang et
al., 1992)
；此外，在高浓度的
NaCl
下，经低浓度乙
醇或
2
-丁氧乙醇来沉淀多糖
(Chang et al., 1993;
Manning, 1991; Fang et al., 1992)
。但上述方法虽然
能去除部分多糖，但效果并不十分理想，提取出的
RNA
仍混杂有相当多的多糖
(Ainsworth, 1994)
。第
三种，用改良的
CTAB
法提取富含多糖组织的
RNA(
李映志等
, 2009)
也可有效去除多糖的干扰。前
人的研究的报道为富含多糖的野生西瓜果实
RNA
提取方法的探索提供了有益参考。
本研究以富含多糖的野生西瓜
PI296341-FR
果
实为材料，对三种已报道的富含多糖植物组织
RNA
提取方法进行了筛选、比较和改良，以期摸索出适
合于富含多糖的野生西瓜果实的高质量
RNA
提取
方法，为顺利开展相关分子生物学研究奠定基础。
1
结果与分析
1.1
已报道的三种去除多糖的方法提取野生西瓜果
实
RNA
的效果
根据野生西瓜果实富含多糖的特点，本实验选取
了三种已报道的能有效去除多糖的
RNA
提取方法
(
改
良
CTAB
法，改良
LiCl
法，
SDS
法进行筛选。琼脂
糖凝胶电泳检测结果表明三种方法均未能成功提取
出野生西瓜果实完整果实总
RNA(
图
1)
表明这三种方
法均不适合于用作野生西瓜果实
RNA
的提取。
图
1
三种方法提取野生西瓜果实总
RNA
的效果
注
: 1:
改良
CTAB
法
; 2:
加
CaCl
2
处理法
; 3: SDS
法
Figure 1 The efforts of three methods for wild type watermelon
fruit total RNA extraction
Note: 1: Modified CTAB; 2: Added CaCl
2
; 3: SDS
1.2 SDS
法的改良
本实验室栽培西瓜果实
RNA
提取均采用
SDS
水饱和酚法
(Guo et al., 2011)
，因此本研究的重点是
对该方法进行改良，改良的思路重点参考李映志等
(2009)
报道的方法。改良的重点主要是在
PCI(
酚
:
氯仿
:
异戊醇比例为
25:24:1)
抽提前加入
5 mol/L
醋
酸钾缓冲液
(pH 6.0)
和无水乙醇以去除多糖干扰。鉴
于参考该方法的提取效果并不理想
(
方法Ⅳ
)
，本研究同
时参考其他成功去除多糖的研究报道
(López-Gómez
and Gómez-Lim, 1992)
对于加入乙醇和醋酸钾缓冲
液的量做了多次尝试，选取了
6
个具有代表性的方
法
(
表
1)
。通过琼脂糖凝胶电泳检测可知
(
图
2)
：醋
酸钾缓冲液的加入量是影响提取效果的关键；在合
适的醋酸钾缓冲液的加入量的前提下，加入
1/4
体
积无水乙醇的提取效果要比加入
1/10
体积的效果