Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1191
析
(Mochida et al., 2003)
。
SNP
的检测方法有多种，
如：基因测序技术、阵列杂交分析、高效变性液相
色谱检测等
(Jehan and Lakhanpaul, 2006)
，但是由于
技术难度高、成本费用高，阻碍了其应用。酶切扩
增多态性序列
(cleaved amplified polymorphic sequence,
CAPS)
是根据
SNPs
位点的
DNA
序列设计特异的
PCR
引物，与限制性内切酶相结合产生的一种分子
标记。但
SNP
恰好位于限制性酶切位点这种情况比
较少，为了能够检测所有可能的
SNPs
位点，衍生型
酶切扩增多态性序列
(derived cleaved amplified
polymorphic sequence, dCAPS)
技术通过在扩增引物
中加入错配碱基，结合
SNP
位点引入限制性内切酶
位点，从而可以酶切检测几乎所有
SNPs (Michaels
and Amasino, 1998)
。
dCAPS
技术自发明以来大量应
用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研
究，该技术已在水稻
(Komori and Nitta, 2005
；赵红敬
等
, 2011)
、拟南芥
(Nemri et al., 2007; Hou et al.,
2010)
、小麦
(Yanagisawa et al., 2003)
、大麦
(Shahinnia
and Sayed-Tabatabaei, 2009)
、葡萄
(Boss and Thomas,
2002)
、香蕉
(
Umali and Nakamura, 2003
)
、山茶
(
张成
才等
, 2012)
等作物中得到了广泛的应用。
本研究通过对金花茶
psbA-trnH
、
rbcL
、
trnL-F
、
GBSSI
基因的
PCR
扩增，通过生物信息学方法进行
SNP
位点序列分析，设计金花茶物种特异的
PCR
引
物，应用专一的限制性内切酶，最终将
SNPs
转化为
dCAPS
标记进行检测，建立了金花茶物种的快速鉴
定方法。
1
结果与分析
1.1
序列比对及
SNP
位点分析
对金花茶组植物
psbA-trnH
、
rbcL
、
trnL-F
、
GBSSI
基因的序列进行分析，四个基因的扩增效率均为
100%
，扩增序列片段长度排序后分别为
469 bp
、
732 bp
、
976 bp
、
759 bp
，
GBSSI
基因序列提供最多
的变异位点
(53
个
)
及最多的信息位点
(21
个
) (
表
1)
。
因此，后续选择
GBSSI
基因序列对金花茶组植物进
行物种特异引物的设计。
1.2 dCAPS
标记的转化
序列比对分析中发现金花茶的
GBSSI
基因的第
141
个碱基为
T
，而其它种为
C (
图
1)
。根据此
SNP
位
点设计合成
dCAPS
引物
(
图
2;
表
3)
，错配碱基为
C→A(
图
2)
。
dCAPS
引物和下游引物
PCR
扩增出
单一的目的条带为
254 bp
，结果与预期一致
(
图
3A)
。
用相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切
产物中只有金花茶
(
图
3B)
有
254 bp
和
229 bp
两个
片段，而其它近源种只有一个
254 bp
片段，从而将
金花茶与其它近源种分开。
2
讨论
单核苷酸多态性标记因为数量多、分布广泛、
适于快速规模化筛选等优点在遗传图谱构建、种质
资源遗传多样性、分子育种等领域有广泛的应用前
景。
SNP
的开发和检测技术也不断发展成熟。目前，
发掘
SNP
标记的方法主要包括：基于表达序列标签
(expressed sequence tag, EST)
数据开发
SNP
位点、基
于微阵列芯片开发
SNP
、扩增子重测序开发
SNP
和
基于全基因组序列的
SNP
标记开发
(
洪彦彬等
, 2011;
张成才
, 2012)
。
SNP
的检测技术多种多样，如：凝
胶分析技术、荧光检测技术、
DNA
芯片检测、质谱
检测技术和色谱技术等，但是它们多数对设备和技
术要求高，成本较高
(
张成才
, 2012)
。
本实验针对金花茶物种设计了特异引物，能迅
速地将金花茶与山茶属其它近源种区分，其中
dCAPS
引物的设计是将
SNP
转化为
dCAPS
标记的
关键，通过软件共设计了
16
个
dCAPS
上游引物，
表
1
四个基因片段的信息参数
Table 1 Informative parameters of the four DNA regions
psbA-trnH
rbcL
trnL-F
GBSSI
长度范围
(bp)
Length range (bp)
396~459
697~722
919~954
652~749
排列长度
(bp)
Aligned length (bp)
469
732
976
759
变异位点
(%)
No. of variable sites (%)
6 (1.28%)
1 (0.14%)
9 (0.92%)
53 (6.98%)
信息位点
(%)
No. of parsimony informative sites (%)
6 (1.28%)
1 (0.14%)
1 (0.10%)
21 (2.77%)