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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1383
-
1389
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1383
-
1389
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1384
至有试验发现蓝莓在以硝态氮为氮源的基质中生
长量大于以铵盐为氮源的生长量
(Kender and
Childers, 1959)
。由于蓝莓根系自然状态下均能形成
杜鹃花类菌根
(ericoid mycorrhizas, ERM)
，
Read
(1996)
推测菌根可能增强了寄主植物利用硝态氮的
能力
(Read, 1996)
。此后，经过
ERM
真菌纯培养以
及接种蓝莓
(Kosola and Workmaster, 2007)
、云锦杜
鹃
(
Rhododendron fortunei
L.) (
尹丽娟等
, 2010)
试验
进一步证明
ERM
真菌具有吸收利用硝态氮的能力。
但研究者未曾就
ERM
真菌吸收硝态氮的机制进行
深入研究。
抑制性差减杂交
(suppression subtractive hybrid-
dization, SSH)
自
1996
年由
Diatchnoko
等发明以来，
由于其具备特异性高、假阳性率低，对低丰度基因
有较好的分离效果等优点，被广泛用于分离各类生
物体的差异表达基因，这些基因主要涉及生命活动
包括胚胎发育成花等机体发育
(
黄鑫
, 2008;
侯雪丽
,
2009)
、形态建成
(
王永胜等
, 2001;
张雷等
, 2002,
自
然科学进展
, 12(3): 261-265)
、生物与非生物胁迫
(
申
贵
, 2005)
等。
本研究以
ERM
真菌中最为普遍的一类真菌为
试验材料，利用抑制性差减杂交
(suppression subtra-
ctive hybridization, SSH)
首次构建了
ERM
真菌硝态
氮诱导下的
cDNA
文库，以期从中得到
ERM
真菌
硝态氮代谢相关的基因序列，为揭示
ERM
硝态氮
代谢机理提供参考资料。
1
结果分析
1.1
总
RNA
质量检测及
mRNA
的分离纯化
提取的总
RNA 28S
和
18S
带型清晰，与
EB
结
合量比值接近
2:1
，且两条带之间未出现弥散现象，
几乎没有
DNA
污染
(
图
1)
。对照和处理组总
RNA
OD
260
/OD
280
分别为
1.900
和
1.860
，介于
1.7~2.0
之
间
(
表
1)
，说明所提
RNA
样品受多糖、蛋白质等物
质污染程度较小，质量较好，纯度高。分离的
mRNA
在琼脂糖凝胶上呈均匀的弥散状
(
图
2)
，说明采用
Promega
公司的
PolyATract Systems
Ⅲ
(9Z5300)
纯化
出的
mRNA
具有较好的完整性，未被降解，可用于
后续文库构建。
1.2 SSH
文库构建效果检测
1.2.1
Rsa
Ⅰ酶切效率分析
取处理组和对照组
mRNA
各
2 µg
，反转录成
双链
cDNA
后，经
Rsa
Ⅰ酶切，并用
2%
琼脂糖
/EB
胶电泳检测酶切效率
(
图
3)
，处理组和对照组的完整
图
1
总
RNA
电泳图
注
: CK
及
1, 2, 3, 4
分别为四个取材时间的对照和处理样品
RNA; M: DL2000 maker
Figure 1 The agarose gel electrophoresises of total RNA
Note: CK and 1, 2, 3, 4 are the agarose gel electrophoresises of
total RNA from control and treated samples taken at four
different times; DL2000 maker
图
2 mRNA
电泳图
注
: D:
对照
; T:
处理
; M: DL2000 marker
Figure 2 The agarose gel electrophoresises of mRNA
Note: D: Control; T: Treated; M: DL2000 marker
cDNA
从
100 bp
到点样孔成弥散状分布，主要集中
在
150~2 000 bp
以上，酶切后
cDNA
较酶切前分布
范围明显下移，亮度主要集中在
200~700 bp
之间，
说明酶切效果较好，可用于后续接头的连接和差
减杂交。
1.2.2
抑制性差减杂交
(SSH)
后二次
PCR
产物分析
差减片段经两轮
PCR
扩增后，二次
PCR
产物
电泳结果
(
图
4)
显示，差异片段得到了有效富集，扩
增
cDNA
片段成弥散状分布，未见明显特异性条带，
说明抑制性差减杂交和
PCR
扩增效果较好。
1.2.3
文库插入片段的大小检测
随机挑选
46
个克隆进行
PCR
扩增，检测所构
建文库中插入片段的大小，结果如图
5
所示：插入
片段最小为
200 bp
，最大为
1 000 bp
，大部分集中在
400 bp
左右。表明连接、转化效果较好，片段大小
符合文库构建质量要求。
1.2.4 cDNA
文库中
ESTs
序列及功能分析
300
个阳性克隆测序完成后，共有
270
个克隆