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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1312
-
1316
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1312
-
1316
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1314
因的植物表达载体
pBI-
pta
(
图
3)
，导入
E. coli
DH5α
。
进行酶切和
PCR
，均得到一条
1 069 bp
目标片段，
说明
pBI-
pta
植物表达载体的构建是正确的，可以
用于基因转化研究。
1.5
转基因棉花植株及其后代的抗性筛选和分子鉴定
以陇棉
2
号为受体材料，做
2 000
个导入处理，
收获
T
0
棉铃共
130
个，导入材料成铃率为
6.5%
。
将
T
0
棉铃种子按单粒种植，经卡那霉素筛选获
得
T
1
抗性植株
5
株，单株收获并进行室内考种。抗
性植株与对照田间调查和室内考种发现，两者在植
株形态与经济性状上无明显差别。
用
2 500 mg/L
卡那霉素连续涂抹棉花第一片真
叶
7 d
后，对照及导入材料仅有个别植株
(<5%)
有叶
片变薄、变大和发黄症状；
4 000 mg/L
卡那霉素涂
抹
5~7 d
后，约有
50%
以上植株叶片明显黄化或出
现黄色斑点；
6 000 mg/L
卡那霉素涂抹
3~6 d
后，
约
50%~96%
植株黄化
(
图
4)
。在后续转基因棉花的
筛选中直接选用了
6 000 mg/L
卡那霉素作为筛选浓
度、筛选周期为
6 d
，每批转基因材料筛选周期缩
短约
14 d
。
T
2
植株中，
23
株卡那霉素
6 000 mg/L
的黄化
植株
PCR
扩增没有出现
pta
和
npt
Ⅱ目的条带；
14
株
抗性植株中有
6
株扩增出了
npt
Ⅱ的目的条带
(
图
5)
，
但都没有扩增出
pta
基因。
PCR
分子鉴定结果初步
表明，外源
npt
Ⅱ已整合到棉花的基因组中。
2
讨论
在早先的实验中，证明所克隆的半夏凝集素基
因具有较好的抑制蚜虫效果，转基因烟草植株的蚜
口密度抑制率在
25.5%~89.4%
，平均蚜口密度抑制
率为
56.2% (
张正英等
, 2010)
。本研究通过花粉管通
道法将半夏凝集素基因直接转入棉花品种陇棉
2
号
中，通过抗性筛选和
PCR
分析证明获得了转基因后
代。对
T
1
抗性植株在伏蚜期田间调查单株蚜量，以
棉株顶部
5
叶中受害叶最重叶片为标准叶，结果初
步显示抗性植株对棉蚜表现中抗水平，抗性植株蚜
害减退率较对照高
10%
。抗虫性是否稳定表达，需
要继续验证。
花粉管通道法操作简单，转化成本较低，为农
作物育种提供了创造新种质的新途径。多数利用花
粉管通道法获得转化棉花后代的研究报告，提供了
分子生物学证据
(
翁坚等
, 1984;
郭三堆等
, 1999;
邓
德旺等
, 1999)
。但是，转化后代假阳性植株多，鉴
图
4 6 000 mg/L
卡那霉素筛选转化棉花
Figure 4 Transgenic cotton identified by kanamycin selection
with 6 000 mg/L
定工作量大，总体转化效率低
(
周小云等
, 2008,
生
物技术
, 18(2): 93-95)
。本研究从
6 000 mg/L
卡那霉
素抗性植株中检测出了报告基因
npt
Ⅱ，而非抗性
植株没有扩增出
npt
Ⅱ基因，说明
6 000 mg/L
卡
那霉素的筛选是可靠的。但这个浓度比刘方等
(
刘方
等
, 2008,
中国棉花
, (8): 16)
建议的要高，与马纪等
(2008)
相同。
在经卡那霉素抗性筛选的
PCR
分子鉴定中，没
有扩增到
pta
，可能与马盾等
(
马盾等
, 2007,
新疆农
业科学
, 44(S3): 105-107)
报道的外源基因丢失和外
源
DNA
的遗传不稳定有关。
本研究中选用了
4
种不同的受体材料，所做处
理数相同，但只有陇棉
2
号得到的转化植株，这是