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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1312
-
1316
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1312
-
1316
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1313
国内部分实验室应用半夏凝集素基因
(
pta
)
在
水稻
(
张红宇等
, 2003)
及百合
(
唐东芹等
, 2004)
、菘蓝
(
许铁峰等
, 2003)
等植物上开展了转基因研究，获得
了一些转基因工程植株，显示出良好的抗虫性能和
应用前景。
甘肃西和半夏是半夏之精品，享有盛誉。本研
究克隆了甘肃西和半夏凝集素完整基因，通过花粉
管通道法开展了棉花转基因研究，旨在建立棉花转
基因方法和培育抗虫种质。
1
结果与分析
1.1
半夏凝集素基因
(
pta
)
扩增
扩增模板
DNA
为提取纯化的半夏叶片基因组
DNA
，特异引物为
pta
-F
、
pta
-R
，通过
PCR
扩增获
得目的基因片段长度约
1 000 bp
，长度与实验设计
预期结果一致
(
图
1)
。
图
1 PCR
扩增半夏
DNA
片段
注
: M: 100 bp DNAmarker; 1,2: PCR
产物
Figure 1 DNA fragment of Pinellia ternate amplified by PCR
Note: M: 100 bp DNAmarker; 1,2: PCR product
1.2
目的基因的克隆与鉴定
按照回收试剂盒说明，纯化回收
PCR
扩增产
物，将其连接到
pGEM-T
载体上，转化大肠杆菌
DH5α
。少量提取重组质粒用
Xba
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切
及
PCR
进行鉴定
(
图
2)
，结果都出现了大约
1 000 bp
的序列片段，其长度与扩增片段相符。证明
pGEM-T
载体构建是正确的
(
图
2)
。
1.3
半夏凝集素基因
(pta
)
序列及其编码氨基酸分析
pta
序列测定结果表明
(
图
3)
，扩增片段全长为
1 069 bp
，应用
DNAMAN 6.0
对序列进行分析，在
序列的
29~835 nt
处发现一连续
ORF
，第
29~31 nt
处是该序列的转录起始密码子
ATG
，
833~835 nt
为
终止密码子，全编码区为
804 bp
，编码一条
268
个
氨基酸残基的多肽，预测分子量
29.1 kD
，等电点
为
7.77
。
5'
端非编码区
(5'UTR) 28 bp
，
3'
端非编码区
(3'UTR) 234 bp
。在
poly(A)
上游存在典型的真核生
物基因
poly(A)
的信号序列-
AATAAA
。第
27~120
位
图
2 pGEM-T-
pta
重组质粒
PCR
及酶切鉴定
注
: M: DL2000 DNA marker; 1,2,3: PCR
扩增产物
; 4:
阴性
对照
; 5,6:
Xba
Ⅰ和
Sma
Ⅰ双酶切产物
Figure 2 Identification of pGEM-T-
pta
by PCR and Enzymetic
digestion
Note: M: DL2000 DNA marker; 1,2,3: PCR Dproduct; 4:
Negative control; 5,6: Digesting products by
Xba
Ⅰ
,
Sma
Ⅰ
氨基酸残基、第
144~177
位氨基酸残基分别为两个
保守结构域，第
1
个结构域含
1
个甘露糖结合位点，
第
2
个结构域含
2
个甘露糖结合位点，具有甘露糖
结合植物凝集素的典型特征
(Lin et al., 2006)
；分析
pta
编码蛋白
N
-末端序列，发现序列中
N
-端有
21
个氨基酸残基的信号肽，剪切位点位于第
24
位的
丙氨酸
(A24)
和第
25
位的缬氨酸
(V25)
之间；前端
33
个氨基酸和中间区域第
118~155
位的
37
个氨基
酸残基主要是由一些疏水性氨基酸组成的肽链，其
余区域以亲水性氨基酸组成，从整体来看，
pta
在一
级结构上以亲水性为主。
pta
已在
GenBank/EMBL
中登记，登录号
AY725425
。与已报道的同科
PTA
基因核苷酸序列比对分析显示，该基因序列也有相
似的保守序列域和
QXDXNXVXY(QDNVY)
甘露糖
结合识别区，因而推测也应具有相同的抗虫功能。
图
3
表达载体
pBI-
pta
结构简图
Figure 3 The scheme of plasmid pBI-
pta
1.4
表达载体
pBI-
pta
的构建与鉴定
用
Xba
Ⅰ和
Sma
Ⅰ限制性内切酶对质粒
pGEM-
pta
进行酶切，回收
1 069 bp
的目标片段。
用
Xba
Ⅰ和
Sma
Ⅰ限制性内切酶消化
pBI121
质粒
后，补平经
Sma
Ⅰ粘端，然后将回收的
pta
基因通
过粘端
(
Xba
Ⅰ
)
-粘端
(
Xba
Ⅰ
)
、平端
(
Sma
Ⅰ
)
-平端
(
Sma
Ⅰ
)
连接，得到由
CaMV 35S
启动子驱动的
pta
基