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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1447
-
1457
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1447
-
1457
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1455
米粒状且分散的愈伤组织，这是水稻悬浮细胞培养
技术的关键和难点。本研究建立了供试水稻材料的
悬浮细胞培养技术，该技术水稻悬浮细胞培养
7 d
为
一个生长周期，第
3~4 d
，物质累积最大。该技术的
建立，可用于深入研究转
C
4
pepc
基因水稻高光效的
分子机理。
3
实验材料与方法
3.1
实验材料
实验使用的水稻材料为高表达玉米
C
4
型光合酶
基因
pepc
水稻
(PC)
和未转基因的野生型
Kitaake (W-
T)
，分别保存在江苏省农业科学院内
(
李霞等
, 2001)
。
3.2
培养基的配置
3.2.1
水稻愈伤组织诱导的培养基
本研究采用的基本培养基为
M8
和
N6
，按其大
量元素、微量元素及其有机成分的比例配制，其中
M8
参照梅传生等方法
(
梅传生等
, 1988)
，琼脂浓度
为
8 g/L
，蔗糖浓度为
30 g/L
；设置附加
0~5 mg/L
的
2,4
-
D
；
0~1 mg/L
脱落酸
(absciss acid, ABA)
；
0~3 mg/L
6
-苄基氨基嘌呤
(6
-
BA)
，
pH 5.8
，在
120
℃下高压
灭菌
20 min
。
3.2.2
水稻愈伤组织继代的培养基
水稻愈伤组织继代培养基是参照
N6
的基本成
分配制，蔗糖浓度为
30 g/L
，添加不同浓度的
2,4
-
D
、
A-BA
、
6
-
BA
和细胞分裂素
(KT)
等，琼脂浓度配置
3
个浓度，分别为
7 g/L
、
8 g/L
和
9 g/L
，
pH
为
5.8
，
在
120
℃下高压灭菌
20 min
。
3.2.3
水稻悬浮培养的液体培养基
基本培养采用
N6
的大量、微量元素及有机成
分配置，并添加的蔗糖浓度为
30 g/L
，琼脂为
8 g/L
，
脯氨酸为
2.8 g/L
，水解酪蛋白为
0.3 g/L
，
2,4
-
D
浓
度为
2 mg/L
，
pH 5.8
，在
120
℃高压灭菌
20 min
。
3.2.4
供试水稻成熟胚愈伤组织的诱导
参照李霞等
(2005b)
方法，将供试水稻成熟种子
去种壳，经
75%
乙醇浸泡，表面消毒
5 min
，弃去
该消毒液，再用
0.1%
升汞溶液浸泡
15 min
，再弃该
消毒液，最后用无菌水冲洗
4
次，放入
(28
±
2)
℃培
养室过夜，次日再用
70%
乙醇浸泡，以进行第二次
表面消毒，
5 min
后弃该消毒液，之后用
0.1%
升汞溶
液浸泡，
5 min
后弃该消毒液，最后用无菌水冲洗
4
次。将消毒的稻种分别接种到不同的诱导培养基
中，以上操作均在无菌的超净工作台进行，然后，接
种好的培养基分别放在不同的培养温度下，暗培养
30 d
．统计愈伤数，计算诱导率。
3.2.5
供试水稻成熟胚愈伤组织的继代培养
将上述供试水稻材料成熟胚诱导的愈伤组织，
转移到继代培养基上，继代培养基的成分见表
12
，在
(28
±
2)
℃暗培养，隔
7 ds
继代
1
次，记录供试水稻
材料愈伤组织的生长情况。
3.2.6
供试水稻悬浮细胞培养系的建立
按照王满
(2011)
的方法，挑选继代培养中米粒
状、疏松且分散的愈伤组织块约
3 g
，转接到
100 mL
容积为
250 mL
的三角瓶的液体培养基中，放在恒
温摇床上，进行培养，培养温度为
(28
±
2)
℃，摇床
转速
(110
±
10) rpm
。培养第
7 d
后，进行第一次液体
培养基的继代培养，除去较大颗粒的细胞团，保留
1/3
的培养原液以及
1 mm
直径的愈伤组织颗粒，再补
充新鲜培养液到
100 mL
，以相同的培养温度和转速
培养，每
7 d
转接新鲜的培养基，继代培养
1
次。当
继代
6
次以后，就可建立高频和稳定的水稻悬浮细
胞技术体系。
3.2.7
水稻悬浮细胞生长曲线的测定
将得到均一水稻悬浮细胞，称取等质量的水稻
悬浮细胞培养物，分别转接于含有不同
2,4
的培养
基，分别称量不同时间培养的水稻悬浮细胞鲜重。并
将等质量的水稻悬浮细胞，移入同样体积的三角瓶
中，培养液总体积为
10 mL
、
20 mL
和
30 mL
，初步
确定供试水稻悬浮细胞生长的最适溶氧量。在水稻
悬浮细胞液总体积相同的条件下，再加入不同比例
的新原液比例，确定供试水稻悬浮细胞生长的最适
新原液比例。供试水稻悬浮细胞的鲜重，则均通过
低温离心，搜集不同培养时间的水稻悬浮细胞培养
物，然后测量其鲜重，然后再放入鼓风干燥箱内，在
120
℃杀青
20 min
后，在
80
℃烘干为恒重，再称其
干重，确定适宜的新原液比例，最后在适宜的培养
条件下，绘制供试水稻材料培养细胞的生长曲线。
作者贡献
王满和石牡丹是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；王满及钱宝云完成数据分析，论文初稿的写作；魏晓东
和方先文参与实验设计，试验结果分析；李霞是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。