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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1408
-
1413
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1408
-
1413
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1409
进行标准化，其目的是校正实验过程中与各步骤相
关的变异，如材料起始量、
RNA
完整性、
cDNA
合
成效率等。
在理想状态下，内对照基因
(
主要为持家基因
)
表达不受实验条件影响
(Schmittgen et al., 2000)
，因
而多数研究者以持家基因为内对照基因进行基因
表达分析。但多数研究表明，内对照基因受实验条
件影响变化较大
(
刘莉铭等
, 2012;
张玉喜等
, 2011;
Mallona, 2010; Gutierrez et al., 2008; Jian et al., 2008;
Jain et al., 2006; Nicot et al., 2005)
。因此，能否正确
选择持家基因为参考基因，直接影响基因表达结
果，甚至产生错误结论。
杨树是世界上栽培最为广泛的林木之一，也是
林木基因组学的模式植物。但是，在研究其基因表
达方面，极少数研究者根据不同实验条件而进行内
对照基因的稳定性分析。目前，仅见
Brunner
等
(2004)
以三角叶杨
(cottonwood hybrid,
Populus trichoca-
rpa
×
P. deltoides
)
为材料
(Brunner et al., 2004)
，对
10
个常用持家基因
(
ACT11
,
ACT2
,
CYP
,
TUA
,
TUB
,
UBQ
,
UBQ-L
,
EIF4B-L
,
EF1β
和
18S
)
在不同发育时期
进行基因表达稳定性研究。
本研究以盐胁迫
(0.6% NaCl)
不同时期
(0, 3 h,
6 h, 9 h
及胁迫
9 h
后恢复
12 h)
的
107
杨叶片为试材，
分析除
ACT2
外
9
个常用持家基因在叶中的表达稳定
性，以期筛选出不同盐胁迫时期表达最稳定的持家
基因作为内对照基因。
1
结果与分析
1.1107
杨叶片总
RNA
质量分析
从图
1
中可判断
28S
条带与
18S
带亮度之比约为
2:1
，紫外可见分光光度计
NanoDrop ND1000 (
美国
)
测得
OD
260/280
在
1.8~2.1
之间。
图
1
盐胁迫处理的
107
杨叶片总
RNA
电泳
注
: 1~3
泳道分别为盐胁迫
3 h, 6 h
和
9 h
的总
RNA
Figure 1 Agarose electrophoresis of total RNA from the leaves
of poplar 107 under salt stress
Note: Lane 1~3 Total RNA from leaves in the stress durations
on 3 h, 6 h and 9 h, respectively
结果表明所提取的总
RNA
样品未降解，完全满
足后续实验要求。利用持家基因
ACT
Ⅱ
引物对反转
录产物进行
PCR
扩增，获得了与预期大小的目的片段
(
图
2)
，说明所提取的
RNA
可成功反转录。
图
2
杨树
ACT
Ⅱ
基因的
RT-PCR
产物
注
: 1~3
泳道分别为盐胁迫
3 h, 6 h
和
9 h
的总
RNA
反转录
PCR
产物
Figure 2 RT-PCR products of poplar
ACT
Ⅱ
gene
Note: Lane 1~3 RT-PCR products from leaves in the stress
durations on 3 h, 6 h and 9 h, respectively
1.2 9
个持家基因的
Real time PCR
扩增效率分析
选择已报道的
9
个常用持家基因用于本实验。
其中，
EF1β
和
1
8S
持家基因引物进行
Real time PCR
时，结果未出现“
S
”形扩增曲线，不适合用于本实
验；另外，
TUA
持家基因引物扩增效率大大超出了
有效扩增效率范围
(
表
1)
，也不适合进行后续研究。
其他
6
个持家基因引物扩增效率在
89.93%~104.68%
之间，且拟合度
R
2
值在
0.987 6~0.999 9
之间，说明
标准曲线线性关系好，确保了
Real time PCR
结果准
确，因此利用这
6
个持家基因进行后续相关研究。
1.3
持家基因表达稳定性分析
geNorm
通过分析持家基因在不同发育时期或
不同胁迫处理样品的表达稳定性
(M)
来筛选最稳定
表达的持家基因的软件，该软件默认
M=0.5
为取舍
值，内参基因的
M
值小于
0.5
，则认为可以考虑作为
内参基因，
M
值越大越不稳定
(
刘莉铭等
, 2012;
王
忠伟等
, 2012;
侯维海等
, 2011)
。根据
geNorm
软件计
算结果，盐胁迫处理条件下，持家基因表达稳定性为
EIF 4B=UBQ>CYP>ACT
Ⅱ
>UBQL>TUB
(
图
3)
；非盐
胁迫对照条件下，持家基因表达稳定性为
EIF 4B=
UBQL>ACT
Ⅱ
>CYP>UBQ>TUB
(
图
4)
。在这两种条
件下，除
TUB
基因外
(M>0.5)
，其余持家基因均可做
为内参基因。
geNorm
软件通过分析内参基因的配对差异值
V
n/n+1
来确定在某种条件下所需内参基因最适数目，