Page 17 - 2012no27

分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1191- 1198 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1191- 1198
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1193
增出的产物很少，而在 0.2 mmol/L~0.3 mmol/L 时
出现的产物最多，并以 0.25 mmol/L 时的条带多而
清晰，在 0.35 mmol/L 时则又无扩增产物。因此，
我们认为 0.25 mmol/L 的 dNTP 浓度应是云南铁壳
麦 SSR 反应的最适浓度。
图 2 dNTP 浓度试验结果
注: M: DL2000 marker, 1~6 泳道的 dNTP 浓度分别为 :
0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.25 mmol/L, 0.3 mmol/L
和 0.35 mmol/L
Figure 2 Result of dNTP concentration
Note: M: DL2000 marker, 1~6 dNTP concentration: 0.1 mmol/L,
0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.25 mmol/L, 0.3 mmol/L and
0.35 mmol/L
1.3 引物浓度的筛选
我们设计了 0.06 μmol/L、0.1 μmol/L、0.14 μmol/L
和 0.18 μmol/L 四种不同的引物浓度来检验 PCR
的扩增效果(扩增结果如图 3)。从扩增出的条带
多少和清晰度看，引物浓度在 0.06 μmol/L 以下
时产生的扩增物太少，甚至根本没有扩增物，在
0.1 μmol/L~0.18 μmol/L 之间时不但有较多的扩增
物，而且以 0.1 μmol/L 时的条带效果最好。因此，
图 3 引物浓度试验结果
注: M: DL2000 marker, 1~4 泳道的引物浓度分别为: 0.06 μmol/L,
0.1 μmol/L, 0.14 μmol/L 和 0.18 μmol/L
Figure 3 Result of Primer concentration
Note: M: DL2000 marker, 1~4 Primer concentration: 0.06 μmol/L,
0.1 μmol/L, 0.14 μmol/L and 0.18 μmol/L
我们选用 0.1 μmol/L 的引物浓度作为云南铁壳麦
SSR 反应的最适浓度。
1.4 模板 DNA 浓度的筛选
实验中对 10 ng、20 ng、30 ng 和 40 ng 四种不
同的模板 DNA 浓度进行了 PCR 扩增检验(扩增结果
如图 4)。模板 DNA 浓度太低，则分子碰撞的几率
也越低，偶然性增大，扩增物也就不稳定；模板浓
度过高则会造成条带模糊，出现弥散现象。从图 4
看，30 ng 时扩增出的条带较其他浓度的都清晰。
因此，我们选用 30 ng 的模板 DNA 作为最适浓度。
图 4 DNA 浓度试验结果
注: M: Ecol-λ T14 marker, 1~5 泳道的引物浓度分别为: 30 ng,
40 ng, 40 ng, 20 ng 和 10 ng
Figure 4 Result of Taq polymerase concentration
Note: M: Ecol-λ T14 marker, 1~5 DNA concentration: 30 ng,
40 ng, 40 ng, 20 ng and 10 ng
1.5 Taq DNA 聚合酶浓度的筛选
在 PCR 反应中，Taq 酶的用量也是影响实验结
果的一个重要因素。使用高浓度的 Taq 酶不但造成
浪费，而且很容易发生高错配率、产生非特异性扩
增物；过低则会导致产物的合成效率下降。在随机
扩增反应中，一般应将 Taq 酶的浓度控制在 0.5 U~5
U 之间(余艳等, 2003)。
我们通过对 0.5 U、1.0 U、1.5 U 和 2.0 U 四种
不同的 Taq DNA 聚合酶浓度的 PCR 扩增(扩增结果
如图 5)表明，Taq 酶浓度在 1.5 U 时扩增出的产物
多且较清晰，而低于 1.5 U 时扩增出的产物减少，
但高于 1.5 U 时又无扩增物出现。因此，为了既不
影响扩增物又避免过多的浪费，我们选用 1.5 U
的 Taq DNA 聚合酶作为云南铁壳麦 SSR 反应的最
适浓度。
1.6 建立优化的 SSR 反应体系
我们通过不同浓度的 Mg2+ 、dNTP、引物、模