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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1191
-
1198
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1191
-
1198
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1192
云南小麦亚种
(
董玉琛等
, 1981)
以来，国内有关研究
人员曾先后对其进行了分类
(
董玉琛等
, 1981)
、抗旱
性鉴定
(
伍少云和奉有壁
, 2001)
、抗条锈病鉴定
(
李
明菊
, 2004;
李明菊和伍少云
, 2005; 2006)
、高分子
量谷蛋白亚基组成及遗传多样性
(
王海燕等
, 2005;
2007;
杨金华等
, 2007)
等研究，以及在研究定位西
藏半野生小麦的断穗基因时，将其与西藏半野生小
麦比较，得出了其控制断穗性状的基因与西藏半野
生小麦的等位
(
陈庆富
, 1999; Chen et al., 1998)
或不
同
(
陆平
, 2000,
西藏农业科技
, 22(2): 23-27)
的结
论。然而，到目前为止，其控制断穗行为的基因所
在的染色体位置及其遗传机制仍没有统一的观点。
另外，也未见有关其抗病基因的定位研究报道，以
致因其在长期相对封闭的生产环境下种植，缺乏与
外界基因的交流而是否形成有抗病新基因等也都
不清楚。
少数几个核苷酸经多次串联重复的
DNA
序列
(Tautz, 1989)
，即称微卫星的简单重复序列
(Simple
sequence repeats, SSR)
的分子标记，由于具有可重
复、稳定和多态性强，已成为了构建高度饱和的真
核生物的基因图谱的标准和理想分子标记，是进行
种质资源和品种遗传多样性分析、并确定其遗传关
系的重要分子技术手段
(Beckmann and Soller, 1990;
Katzir et al., 1996)
。但由于这种微卫星或
SSR
标记
技术是基于
PCR
基础上建立起来的，因此
PCR
的
各种反应条件，如不恰当的模板
DNA
、
Taq
聚合酶、
dNTP
以及
Mg
2+
的浓度和不适宜的退火温度等都会
导致获得的图谱产生弥散背景、扩增出的条带不清
晰或位置改变，甚至无扩增产物等，从而最终影响
对扩增产物的准确统计与分析
(
迪芬巴赫
C.W,
和
德维克斯勒
G.S., 1998)
。所以，在利用
SSR
标记进
行各种研究和分析前，筛选出适合目标
DNA
扩增
的
PCR
反应条件是至关重要的。鉴于目前，国内外
还未见利用
SSR
分子标记开展云南小麦断穗或抗
病基因定位或标记研究的报道，我们旨在开展此项
探索研究之前，首先探讨影响
PCR
反应体系的各种
主要成分浓度或用量对云南小麦断穗和抗条锈病
SSR
引物扩增结果的影响，拟筛选出各种主要成分
的最佳用量或浓度量，建立适合云南小麦断穗和抗
条锈病基因分子标记的最佳
SSR-PCR
反应体系。
1
结果与分析
1.1 MgCl
2
浓度的筛选
由于
Mg
2+
是聚合酶—
Taq
DNA
的催化剂，因
此它的浓度高低将直接影响
dNTPs
与模板
DNA
竞
争结合的强弱、
SSR
引物同模板
DNA
结合的效率
和特异扩增物的产生
(
林万明
, 1993)
。所以，合适的
Mg
2+
浓度是获得清晰扩增条带的首选必须考虑和
优化的因素之一。
采用
1.4 mmol/L
、
1.8 mmol/L
、
2.2 mmol/L
和
2.6 mmol/L
四种不同的
MgCl
2
浓度进行了
PCR
扩
增实验。从图
1
可以看出，当
Mg
2+
浓度在
1.4 mmol/L
时，由于
Taq
DNA
聚合酶未完全被激活，只产生了
很少的扩增产物，且出现了弥散现象。随着
Mg
2+
浓度的增加催化作用也随之逐渐增强，扩增出的产
物也增多，产物的浓度也增大，但当到达一定程度
时，扩增产物反而减少且不清晰。所以，我们认为
在
1.8 mmol/L~2.6 mmol/L
之间的
Mg
2+
浓度是适
合云南小麦断穗与抗条锈
SSR
反应的浓度，且以
1.8 mmol/L
的浓度产生的条带多、清晰程度高。
图
1 Mg
2+
浓度试验结果
注
: M: DL2000 marker, 1~4
泳道的
Mg
2+
浓度分别为
: 1.4 mmol/L,
1.8 mmol/L, 2.2 mmol/L
和
2.6 mmol/L
Figure 1 Result of Mg
2+
concentration
Note: M: DL2000 marker, 1~4 Mg
2+
concentration: 1.4 mmol/L,
1.8 mmol/L, 2.2 mmol/L and 2.6 mmol/L
1.2 dNTP
浓度的筛选
dNTP
的浓度过低，不仅会影响扩增产物的合
成效率，甚至会因
dNTP
过早消耗而使产物单链化，
影响扩增效果；过高则容易引起拖尾，甚至无扩增
产物。另外，无论是过高或是过低，都会使
Mg
2+
产生拮抗作用，特别是在过低时，这种拮抗作用更
为明显。因此，在建立
PCR
反应体系时首先应将
dNTP
的浓度确定在
20 μmol/L~200 μmol/L
之间
(
余
艳等
, 2003)
的范围内。
本实验以
0.1 mmol/L
、
0.15 mmol/L
、
0.2 mmol/L
、
0.25 mmol/L
、
0.3 mmol/L
和
0.35 mmol/L
六种不同
的
dNTP
浓度探讨了
PCR
的扩增
(
扩增效果如图
2)
效果。图
2
表明，在
0.1 mmol/L
的
dNTP
浓度时扩