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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1179
-
1184
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1179
-
1184
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1182
家族成员之一，参与糖类代谢过程；
10
号
(gi|3994-
6606)
醛糖
1
差向异构酶
(
变旋酶
)
负责葡萄糖和其他
醛糖在
α
与
β
形式间的端基互变，涉及碳水化合物
代谢过程。
在氮饥饿诱导下
Y98
-
16
菌株分泌蛋白的表
达量相对于全氮培养条件下上调的蛋白有
8
号
(gi|145602874)
丝氨酸羧肽酶
S28
，他们属于
α/β
水解酶家族成员之一，对丝氨酸羧肽酶类蛋白的
功能研究表明，
SCPL
基因在参与种子萌发中储藏
蛋白的水解、细胞程序性死亡中细胞成分的自溶、
种子发育、抗逆境等诸多过程中起作用；
12
号
(gi|145610386)
糖基水解酶家族
7
，属于葡聚糖酶超
家族成员之一；
20
号
(gi|39971981)
混连葡聚糖酶；
5
号
(gi|39970863)
天冬氨酸蛋白酶，这个家族是肽酶
家族成员之一，可能参与蛋白质的水解，是一种广
泛存在于微生物、动物、植物等体内的酶；
14/15/21
号
(gi|39973165)
脯氨酰寡肽酶家族，参与蛋白质水
解；
16
号
(gi|145613536) ML domain
：磷脂酰肌醇转
移蛋白，与油脂识别有关，特别是在病原菌相关产
物的识别上；
30
号
(gi|39968551) Kelch motif
：是一
个基序，以果蝇的突变体来命名的半乳糖氧化酶；
26
号
(gi|145610394)
蛋白酶相关结构域：这种结构域
在植物的液泡受体中被发现，研究表明这种结构域
形成一个像盖子一样的结构覆盖活性蛋白酶的活
性位点，从而影响液泡受体蛋白的识别。
在氮饥饿诱导下
Y98
-
16
菌株分泌蛋白的表达
量相对于全氮培养条件下下调的蛋白有
28 (gi|399-
76459) β
-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，甘露聚
糖是植物半纤维素的重要组分，甘露聚糖的完全酶
解需要
β
-甘露聚糖酶；
13
号
(gi|39971041)
羧酸酯酶，
它是
α/β
水解酶家族成员之一；
7
号
(gi|39964139)
假想蛋白，功能未知；
22
号
(gi|39952025) WSC
结
构域：这个结构域可能涉及到淡水化合物的合成，
其余功能未知
(
表
2)
。
2
讨论
氮饥饿可能是植物病原真菌侵染至寄主组织
内进一步生长时面临的环境胁迫之一
(Bolton et al.,
2008)
。氮饥饿可影响稻瘟病菌
N
调控相关基因及
部分与致病相关的分泌蛋白质的产生
(Donofrio et
al., 2006)
。但其具体的作用机制目前尚不清楚。本
实验利用双向电泳对比较氮饥饿及含氮培养条件
下稻瘟病菌分泌蛋白质组的差异进行了比较分析。
结果显示，氮饥饿可影响稻瘟病菌
N
代谢及相关调
控相关基因的表达。这些蛋白质表达量的提高反映
了稻瘟病菌为适应氮饥饿胁迫而增强了
N
代谢相
关途径。糖基水解酶
(glycoside hydrolases, GH)
是降
解植物细胞壁多糖成分主要的酶类
(Zoran, 2008)
。
本实验中发现在鉴定的
26
个蛋白点中，氮饥饿诱
导下上调和特异表达的蛋白点有
18
个，占鉴定蛋
白的
69%
，其余
8
个蛋白下调。
Mosquera
等的实验
表明，在稻瘟病菌侵染水稻叶片的早期产生了较大
数量的分泌蛋白质。其中多数是与细胞壁相关的酶
类，本实验利用氮饥饿胁迫后
48 h
后的分泌蛋白质
进行分析，与
Mosquera
等实验中稻瘟病菌侵染水
稻的时间接近。这些结果说明，氮饥饿胁迫可能促
进了稻瘟病菌细胞壁多糖降解酶的产生以有利于
其侵染的进行。分泌蛋白质主要是稻瘟病菌分泌到
寄主组织中，在其二者的相互作用中发挥信号识
别、代谢调控和致病等作用
(Ebbole, 2007)
。本实验
中被鉴定的蛋白可能在稻瘟菌与水稻的互作过程
中发挥着不同的功能，但确切功能将在进一步的实
验中证实，同时在这些蛋白点中，
gi|145605481
和
gi|39971041
已被证明与致病相关
(Jeon, 2007)
，蛋白
点
(gi|145602874)
被证明在水稻侵染期间高度表达
(Mathioni, 2011)
，表明从分泌蛋白中可找到效应蛋
白的候选蛋白。
3
材料与方法
3.1
试验材料
稻瘟菌菌株
Y98
-
16
在含氮液及氮饥饿的液体
培养参考蔡永占等的方法
(
蔡永占等
, 2010)
。将水稻
品种
LTH
的种子在培养箱内
28
℃黑暗培养催芽
3 d
后，移栽温室中生长，待第
4
片叶完全展开时接种。
3.2
液相等电聚焦及致病力检测
将
2 L
氮饥饿诱导下的滤液冻干后，转入透析
袋中于去离子水中透析
24 h
。透析结束后的溶液以
12 000 rpm
、
4
℃离心
20 min
，用加入
3% (w/v)
的
Biolyte
缓冲液
(pI3
-
10)
的
10 mL
去离子水混合后进
行液相等电聚焦电泳。将
Rotofor (Bio-rad)
整套设备
安装完毕后，在阳极电极室内加入
0.1 mol/L
H
3
PO
4
，在阴极电极室内加入
0.1 mol/L NaOH
溶液
各
35 mL
。在电泳槽内加入去离子水以
5 W
恒定功
率电泳至电流强度无明显变化。取出去离子水，加
入
18 mL
混合好的样品溶液以
10 W
固定功率运行。
起始电压在
700 V
左右，在
2 h
后，电压逐步上升
至
1 200 V
，并在
1 250 V
附近小范围变化。当此状