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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1179
-
1184
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1179
-
1184
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1183
态持续
30 min
时，停止电泳，将接样管插入电泳室
上的小孔，用真空泵与接样器连接并抽真空接收
20
个组分的样品。各组分的样品先在
1 mol/L
的无菌
Nacl
溶液中透析一夜，再在去离子水中透析
12 h
以消除
Biolyte
对致病性检测的影响。处理后的样
品冻干后用去离子水重溶用
Bradford
法测定蛋白质
浓度并调整其蛋白质浓度为
1 μg/μL
，以水为对照
用于
LTH
叶片接种的活性测定。致病力大小通过在
水稻叶片致伤接种后病斑的大小进行分析。
3.3
双向电泳
采用三氯乙酸
-
丙酮法提取分泌蛋白
(
蔡永占等
,
2010)
。在蛋白滤液中加入
100%
三氯乙酸至滤液终
浓度为
15%
，充分混匀后
4
℃沉淀过夜，
12 000 rpm
，
4
℃离心
30 min
，弃上清。沉淀用冷丙酮悬浮后于
-
20
℃放置
1 h
。
2 000 rpm
，
4
℃离心
30 min
，弃上
清，将沉淀真空干燥后于-
80
℃保存。沉淀用水化
上样缓冲液重新悬浮，利用
Bradford
法测定蛋白质
浓度，调整上样为
1 mg
，上样体积
600 μL
，进行双
向电泳。用
pH4
-
7 17 cm IPG
胶条
(Bio-rad)
进行水
化。被动水化
14 h
。在
PROTEAN IEF Cell
聚焦仪
(Bio-rad)
上进行聚焦。其电压程序设定如下：
50 V
慢速升压
20 min
；
250 V
慢速升压
30 min
；
500 V
快速升压
1 h
；
1 000 V
快速升压
1 h
；
4 000 V
线性
升压
2 h
；
9 000 V
线性升压
3 h
，并维持运行时间
至
60 000 Vh
结束。聚焦好的胶条分别进行
2
次平
衡操作，每次
15 min
。平衡液母液配方为：
6 mol/L
尿素、
2% SDS
、
50 mmol/L pH8.8 Tris-HCl
、
30%
甘
油和
0.002%
溴酚蓝。第一次平衡时在母液中加入
2%DTT
。第二次平衡时则换为
6%IAA
。平衡好的
IPG
胶条用电泳缓冲液冲洗好后小心地放在
12%
的
凝胶上，在胶条的负极端加入蛋白质分子量
Mark
(SM0431, Fermentas)
，用
1%
琼脂糖封胶液固定好胶
条。用
PROTEANR
Ⅱ
Xi Cell
电泳槽
(Bio-rad)
以恒
电压进行电泳，起始电压为
70 V
，待溴酚蓝指示线
越过胶条后，电压改为
300 V
，至电泳结束。电泳
结束后胶的染脱色及图像的分析见苏源等方法
(
苏
源等
, 2011)
。
3.4
质谱鉴定及数据库检索
将表达量有差异的蛋白质点从胶上取下送上
海中科新生命科技公司在
ABI
公司的串联飞行时
间质谱仪
(4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer)
进
行质谱分析。将通过质谱仪分析获得的质谱峰数据
通过
Mascot
程序
(http://www.matrixsciece.com)
进行
蛋白质检索。检索的数据库为稻瘟病菌基因组的数
据库。检索条件为：
(1)
蛋白质的可信度≥
95%
；
(2)
氨基酸序列覆盖率＞
20%
；
(3)Mowse
值≥
60
(P<0.05)
。对得到的这些蛋白质序列用
SignalP 3.0
软件预测其是否含有信号肽序列
(Bendtsen et al,
2004)
。将质谱鉴定后得到的蛋白质序列在
Gene
ontology
程
序
(http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/blast.cg
i)
中选择稻瘟病菌进行功能分类
(Eilbeck et al.,
2005)
。
作者贡献
孔垂思、苏源和余萍是本实验研究的执行人；孔垂思、
苏源及余萍完成数据分析，论文初稿的写作；杨静和刘林参
与实验设计，试验结果分析；李成云和朱有勇是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家“
973
”项目
(2011CB100400
和
2012CB-
722900)
资助。作者感谢两位匿名的同行评审人的评审和修
改建议。
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