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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1012-1016
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1012-1016
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1013
于
1978
年成功地利用原生质体融合实现
CMS
性状
的转移以来，通过该技术转移和改良作物
CMS
性
状已在芸薹属、水稻、番茄、马铃薯、烟草、胡萝
卜等作物上成功地应用
(
蔡小东
, 2007)
。
Yang
等
(1988)
利用经
60
Co
照射的水稻雄性不育系
A-58
的
原生质体与可育系
‘Fujiminori’
的原生质体电融合
后，获得了
7
个雄性不育水稻新材料；
Stephen
等
(1990)
利用原生质体融合技术将油菜
‘Polima’
胞质
雄性不育性成功转移到甘蓝中；
Sakai
等
(1996)
通过
原生质体融合技术将萝卜恢复系中的一个基因成
功转移到油菜不育系中；司家钢等
(2002)
以胡萝卜
雄蕊瓣化型不育材料与可育材料的原生质体为材
料电融合后，获得了
4
个雄性不育株系，并证实为
胞质杂种；通过原生质体非对称融合技术，惠志明
等
(2005)
获得了花椰菜与
‘Ogura’CMS
甘蓝型油菜
种间杂种。
与其它茄科植物相比，辣椒原生质体培养研究
尚没有取得明显进展，其原因主要在于辣椒原生质
体培养和再生难道大，重复性差。目前，国内外仅
有少量利用不同辣椒品种的子叶和下胚轴为材料
进行原生质体分离、纯化，并获得再生植株的报道
(Donato et al.,1989; Jeon et al., 2007;
何晓明等
,
1997)
，而利用辣椒细胞质雄性不育系为材料进行原
生质体的研究国内外尚未见报道。本试验利用辣椒
细胞质雄性不育系
21A
无菌苗的叶片分离原生质
体，从诸多因素探讨其对原生质体分离产量的影
响，并进行培养获得了愈伤组织，为今后通过辣椒
原生质体植株再生和融合技术转移细胞质雄性不
育性状奠定基础。
1
结果与分析
1.1
酶液组成和浓度对原生质体产量的影响
在原生质体分离过程中，不同种类的酶、浓度
及酶解时间对原生质体产量和活力都有较大影响
(
表
1)
，在供试的
6
种酶组合中，随着酶解液浓度的
降低，原生质体产量也逐步降低。不同酶组合，达
到最大原生质体产量所需的酶解时间不一，总体随
酶解液浓度降低所需酶解时间则适当延长。同时，
添加果胶酶能明显提高原生质体产量和缩短酶解
时间。达到最佳原生质体产量后，如继续延长酶解
时间，由于酶解液中原生质体破裂加速，原生质体
碎片明显增加，原生质体产量反而相对降低。
1.2
低温预处理对原生质体产量的影响
在最佳酶液条件
(EC4)
下，对无菌苗在分离制
备原生质体前进行低温预处理，其原生质体产量呈
显著变化
(
表
2)
。原生质体产量呈现先上升后下降的
趋势，无菌苗在
4
℃下处理
12 h
时产量最高可达为
(7.04+0.33 a)×10
6
cells/g FW
，在而处理
24 h
后原生
质体产量最低，仅为
(2.56+0.32 d)×10
6
cells/g FW
。
处理过程中原生质体产量先上升后下降的原因可
能是，处理前期，低温提高了细胞的耐受性，使其
在酶解过程中不易破碎，进而提高了原生质体产
量。而随着处理时间的延长，辣椒叶片却受到了低
温冷害胁迫，导致细胞失水，进而使能分离完整原
生质体的细胞明显降低。
表
1
酶液组成和浓度对原生质体产量的影响
Table1 Influence of enzymic components and concentrations on the yield of protoplasts
酶液组成
Enzymic components
纤维素酶
(%)
Cellulase (%)
离析酶
(%)
Macerozyme (%)
果胶酶
(%)
Pectinase (%)
最佳酶解时间
(h)
Enzymic dissolving
time (h)
原生质体产量
(×10
6
cells/gFW)
Yield
of
protoplasts
(×10
6
cells/gFW)
EC1
1
0.5
4
6.19+0.02 b
EC2
0.5
0.25
6
5.43+0.03 c
EC3
0.25
0.1
8
3.28+0.12 e
EC4
1
0.5
0.2
3.5
6.42+0.20 a
EC5
0.5
0.25
0.1
5
5.87+0.10 bc
EC6
0.25
0.125
0.05
7
3.72+0.13 d
注
:
同列数据的不同字母表示在
5%
水平上差异显著
Note: Different letters in the same column indicate significant difference at 5% level