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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1133
-
1137
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1133
-
1137
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1135
体培养基对平板上的细菌进行培养，观察其能否正
常生长。事实证明，所有被鉴定的单菌落在液体选
择培养基中过夜震荡培养后都会变浑浊，这表明除
了卡那霉素，它们也同样具有利福霉素的抗性基因。
1.3.1.3
菌落分子鉴定
采用
GUS
基因的扩增引物直接对实验材料花
器官中培养出的菌落进行
PCR
扩增。电泳结果表
明，用于
PCR
验证所选的
7
个农杆菌菌落中的
DNA
片段扩增出的条带，均与阳性对照质粒
(
转化所用质
粒
)
完全一样，大小为
1 000 bp (
图
3)
。这表明，浸
花处理后的花蕾提取物中培养出的细菌正是用于
转化的工程菌。
图
3 GUS
基因的
PCR
鉴定
Note: M: marker; CK1: C58
菌液负对照
; CK2:
质粒阳性对
照
; 1
-
7:
拟南芥花器官中培养出的农杆菌菌落
PCR
条带
;
H
2
O:
水对照
Figure 3 The PCR detection of the GUS gene
Note: M: Marker; CK1: Negative control; CK2: Positive
control; 1
-
7: Agrobacteria in flowers of
Arabidopsis thaliana
;
H
2
O: Blank
1.3.2
拟南芥和不结球白菜“引心
360
”花器官中的
农杆菌数量差异比较
细菌平板计数结果表明在拟南芥和菜心经过
浸花处理的花器官中，形成菌落单元
(cloning
formation unit, CFU)
差异显著。结果表明，在
10
-
5
倍稀释下仍可在处理后的拟南芥花蕾提取物中培
养出一定数量的农杆菌菌落单元；而在同样的处理
条件下，浸花后的白菜花器官中却几乎没有培养出
农杆菌菌落单元，这与拟南芥花器官中农杆菌的培
养结果相比有明显的差异
(
表
2)
。
细菌平板培养的结果在某一方面解释了在浸
花转化中，拟南芥的转化频率为何远远高于白菜。
在同样的浸花条件下，大量的活的农杆菌进入了拟
南芥体内，并存活了相当一段时间
(
浸花后
8
天在稀
释
1 000
倍下花器官中仍培养出一定数量的农杆菌
菌落单元
)
。
2
讨论
Floral dip
法的试验材料是花序，
Bechtold
和
Pelletier (1998)
、
Desfeux (2000)
等的研究结果表明，
floral dip
法中农杆菌的转化目标是雌性生殖细胞。
本实验对拟南芥和白菜处理后花蕾的提取液
进行了农杆菌的平板培养，其
CFU
比较结果差异
显著，说明大量的农杆菌并没有成功的在白菜花器
官中存活。这也解释了为何多次的白菜浸花实验没
有获得转化株。
2.1
花的结构对转化的影响
浸花法的实验材料是花序，首先应当考虑花器
官的结构对转化事件的影响。白菜花器官中未能培
养出与拟南芥数量相当的农杆菌，其中一种原因可
能是大量农杆菌未能顺利进入白菜植株中。花萼花
被闭合过紧，植株表面有绒毛或蜡质，都是阻碍农
杆菌进入的潜在原因。在原位转化技术中，不结球
白菜“四九菜心”通过真空转化的方法被成功转化，
由此推断外界的压力对农杆菌的浸入可能有着促
进作用
(
曹传增等
, 2003; Xu et al., 2008)
。
另外花序中处于不同发育期的花蕾数在总花
蕾中所占的比例及花发育节律存在一定的差异。
Desfeux (2000)
等研究发现，拟南芥中对于
6~11 d
才开花的花蕾，经浸花处理后有转化株产生。而对
于接种后
1~4 d
就开放的花蕾，其后代种子中完全
表
2
拟南芥和引心
360
花蕾提取液农杆菌菌落形成数量比较
(CFUs/g)
Table 2 The comparison of CFUs formed from the extract of flower buds of
Arabidopsis thaliana
and that of pakchoi
处理
浸花后天数
第一组
第二组
第三组
平均
treatment
Days after floral-dip
Team 1
Team 2
Team 3
Average
拟南芥
3
125
375
375
291.7
Arabidopsis thaliana
4
660
740
900
766.7
6
200
80
60
113.3
引心
360
3
0
0
0
0
Pakchoi Yinxin360
4
0
0
0
0
6
0
0
0
0