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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1133
-
1137
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1133
-
1137
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1136
没有转化株。而运用拟南芥心皮不闭合型突变体
(
crc
)
，使转化率提高了近
6
倍。可以推断心皮处于
开放状态的花蕾有利于转化事件的发生。还有研究
表明拟南芥中心皮在开花前
3 d
才闭合，而不结球
白菜“四九菜心”中，心皮早在花蕾开放的
10 d
以
前就发生了闭合，认为心皮的闭合时间是造成菜心
的转化效率低于拟南芥的主要原因
(Cao et al., 2000)
。
2.2
植物体内农杆菌的生存
由实验结论得出的另一个推断，是白菜植株体
内的微环境对农杆菌的存活可能是不利的。
CFU
调
查发现，植株中农杆菌的活力受到了严重的抑制，
涂板后三天内不能培养出大小正常的菌落。相似的
情况在徐恒戬等
(2005)
的研究中也有指出，并表明
无论在花，茎还是叶中，
CFU
数量随着植株处理后
恢复时间的延长迅速减少。
农杆菌在植株体内的长期生存有利于遗传转
化。在植物组织中得以生存的农杆菌可能通过对种
质细胞的转化产生可遗传的转基因植株。
Rakousky
(1997)
等对农杆菌渗透处理后的拟南芥进行了
GUS
瞬时表达研究，发现农杆菌能在处理植株的表面和
内部存活很长一段时间，即便是在处理后
3~6 d
的
植株中，植物组织中的农杆菌数量仍可以达到
1.2
×
10
8
个
/g (Rakousky, 1997)
。这说明拟南芥体内的环
境可能有利于农杆菌的存活，一方面也解释了浸花
转化技术中拟南芥为何可以获得较高的转化效率。
3
实验材料与方法
3.1
材料
3.1.1
植物材料
采用不结球白菜“引心
360
”和拟南芥为试材。
3.1.2
工程菌
农杆菌为
C58
菌株，菌株携带的质粒
T-DNA
中
含有标记基因
bar
(
编码对除草剂
Basta
的抗性
)
和
GUS
报告基因，具有利福霉素和卡那霉素的抗性。
3.1.3
试剂
实验所用常规试剂及染色试剂均购自北京益
利精细化学公司，
PCR
试剂购自天根生物工程有限
公司，引物由奥科生物工程有限公司合成。
3.2
浸花处理
处理材料为蕾期植株，处理方法参照
Clough
和
Bent
等
(1998)
。收集过夜培养的菌体重悬浮在含
0.04% 6
-
BA
，
0.05% Silwet L
-
77
，
5%
蔗糖的
1/2MS
液体培养基中，
OD
600
=0.9
。将花序浸没入农杆菌悬浮
液中，浸花时间为
1.5 min
，处理两次，每次间隔
5 d
。
3.3
种子抗性筛选
将浸花后的植株收得的种子播于苗盘中，于子
叶期喷洒
ppt
浓度为
0.225 g/L
的
Basta
溶液。一共
喷洒两次，每次间隔
7 d
。
3.4 GUS
基因的活性检测
取抗性植株的叶片和幼嫩茎杆进行
GUS
表达
稳定性检测，验证目的基因是否已经导入受体植株
(
付绍红等
, 2004)
。
3.5
处理植株花蕾中农杆菌的培养
浸花处理后的植株，称取花蕾
0.1 g
左右，
3%
次氯酸钠表面消毒
10 min
，花蕾的研磨和提取液的
梯度稀释方法参照徐恒戬等
(2005)
。以未做浸花处
理的植株提取液为对照，将稀释好的花蕾提取液涂
板培养。农杆菌筛选培养基配方：每
1 L
培养基中
含甘露糖醇
15 g
，
Ca(NO
3
)
2
•
2H
2
O
：
20 mg
，
NaNO
3
：
5 g
，
KH
2
PO
4
：
2 g
，
LiCl
：
6 g
，
MgSO
4
•
7H
2
O
：
0.2 g
，
溴百里酚蓝
0.1 g
，琼脂
15 g
，
pH 7.2
。高温高压灭
菌冷却后加入卡那霉素至终浓度
100 mg/L
。
3.6
对花蕾提取液中培养出的菌落进行验证
3.6.1
筛选平板中菌落的形态鉴定
在筛选平板中长出的菌落，已经通过了卡那霉
素的初步筛选。观察生长出的菌落外观是否符合农
杆菌菌落在筛选培养基中的特点。
3.6.2
利福霉素的抗性鉴定
随机挑取农杆菌筛选平板上的单菌落，独立接
种到
1 mL YEB+50 μg/mL Kan+25 μg/mL Rif
的液
体培养基中，
28
℃，
200 r/min
避光过夜培养。观察
培养基的颜色变化，转化所用工程菌由于同时具有
利福霉素和卡那霉素的抗性，会在含有这两种抗生
素的培养基中正常生长
(
徐恒戬等
, 2005)
。
3.6.3
分子鉴定
采用菌落
PCR
对平板中培养出的菌落进行分
子鉴定，
GUS
基因引物序列如下：
primer-L
：
5'
-
CAACTGGACAAGGCACTAGCGG
-
3'
；
primer-R
：
5'
-
CCATACCTGTTCACCGACGACG
-
3'
。
PCR
反应
体系
(20 μL)
：
10
×
buffer 2 μL
，
dNTP (10 mmol/L)
0.4 μL
，
Primer-L/R (50 μmol/L)
各
0.4 μL
，
plasmid
DNA 100 ng
，
Taq
酶
1 U
。