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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1122
-
1126
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1122
-
1126
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1123
为
17 bp
，
18 bp
，正向引物用来扩增外显子，反向
引物特异扩增启动子区域、内含子区域。个体不同
导致启动子、内含子和间隔区长度的不同，从而产
生了
SRAP
的多态性。
SRAP
在对分子遗传图谱的
构建、遗传多样性研究及种质资源的鉴定、作物起
源与进化关系研究上以及作物目标性状连锁标记
研究上都有广泛的应用
(
李严和张春庆
, 2005;
柳李
旺等
, 2005)
。
SRAP
的操作简便，具有高度共显性，遍布整
个基因组，在基因组中分布均匀，便于克隆测序目
标片段，可用于基因定位、基因克隆、遗传图谱构
建等。
SRAP
标记最早是应用于芸薹属作物的研究，
随后被迅速应用到各种作物的研究中，目前在水
稻、油菜、番茄、棉花、马铃薯、大蒜、柑橘、辣
椒、小麦、拟南芥等
(
林忠旭等
, 2003;
王凤涛等
2009;
王刚等，
2004,
中国科学
C
辑
, 34 (6): 510-516;
杜
晓华等
, 2006;
张丽等
, 2007;
张安世等
, 2010)
作物
研究中成功应用。本文将
SRAP
应用于大豆抗豆卷
叶螟研究上。
1
结果与分析
1.1 Mg
2+
浓度对扩增反应的影响
试验设置
Mg
2+
在反应体系中的浓度梯度为五
个：
1 mmol/L
、
1.5 mmol/L
、
2.0 mmol/L
、
2.5 mmol/L
、
3.0 mmol/L
。反应产物经丙烯酰胺凝胶电泳分离后
结果表明，当
Mg
2+
浓度在
1.0 mmol/L~3.0 mmol/L
时，均能扩增出产物。而当
Mg
2+
浓度在
1.0 mmol/L~
2.0 mmol/L
时，产物量多，条带越来越清晰；而
Mg
2+
浓度在
2.5 mmol/L~3.0 mmol/L
时，产物量下
降，带型模糊。反应体系中
Mg
2+
浓度直接影响体系
中
Taq
酶活性，体系中
Mg
2+
不足则
Taq
酶活性不足，
反应产物少；若体系
Mg
2+
过量，则过量的
Mg
2+
会与
dNTP
络合，反应产物同样会减少。因此，本试验反
应体系中
Mg
2+
浓度
2.0 mmol/L
时为最佳反应浓度。
1.2 dNTP
浓度对扩增反应的影响
dNTP
在反应体系中的浓度直接或间接影响扩
增产物量得多少，体系中
dNTP
不足，扩增产物少，
而过多的
dNTP
则会与
Taq
酶竞争
Mg
2+
，从而影响
Taq
酶的活性，
Taq
酶活性降低则产物量减少。本
试验设置各
dNTP
的浓度梯度为：
0.05 mmol/L
、
0.10 mmol/L
、
0.15 mmol/L
、
0.20 mmol/L
、
0.25 mmol/L
。
结果表明，当体系中各
dNTP
的浓度从
0.05 mmol/L
~0.20 mmol/L
梯度上升时，条带清晰明显；当
dNTP
浓度达到
0.25 mmol/L
时反应产物量下降。因此在
dNTP
的浓度选择上，本试验最佳浓度为
0.20 mmol/L
。
1.3 Taq
酶浓度对扩增反应的影响
Taq
酶在
PCR
中起到关键作用。在反应中加入
过多的
Taq
酶，会产生非特异性扩增；过少则直接
导致产物量合成少。本试验设置的
Taq
酶梯度为：
0.5 U
、
1.0 U
、
1.5 U
、
2.0 U
、
2.5 U
。由图
3
可见，
随着
Taq
酶的增加，扩增产物量明显增多，当
Taq
酶加入量达到
2.0 U
时出现了非特异性扩增，且泳
带拖尾现象明显。因此，从本试验的结果可得出，
体系
20 μL
时，
Taq
酶加入量为
1.5 U
时为反应最佳
条件。
1.4
稳定性检验
由以上试验结果可知，本研究建立大豆最优
SRAP-PCR
反应体系，即
20 μL
的反应体系中各
组分为：
Mg
2+
浓度为
2.0 mmol/L
，
dNTP
的浓度
0.20 mmol/L
，
Taq
酶为
1.5 U
，正、反向引物的浓
度均为
0.5 μmol/L
，
DNA
为
50 ng
。利用该体系对
12
份大豆对卷叶螟具有抗感性材料进行扩增，经
6%
聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，谱带清晰重复
性好如图
1
所示。这说明该优化
SRAP
体系稳定可
靠，可用于研究大豆分子标记分析。
1.5
引物扩增多态性
反应体系经优化后，以
12
份抗感大豆材料为
模板，用
27
个正向引物，
40
个反向引物的
1 080
图
1
引物
Me19Em1
及
Me19Em2
扩增产物
SRAP
图谱
注
: 1~12
分别为
12
个不同品种的大豆
Figure 1 SRAP finger print of 12 soybean varieties genetated
by primers Me19-Em1 and Em19-Em2
Note: 1~12 standfor 12 varieties of soybean respectively