Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1122
-
1126
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1122
-
1126
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1124
对引物组合进行扩增，
PCR
扩增产物经凝胶电泳，
银染结果显示：具有清晰条带的引物有
866
对，占
所有标记数的
80.2%
；其中具有多态性的引物为
516
对，是所有引物组合的
47.8%
，在可扩增出产物的
引物组合中占
60.6%
，无法扩增出产物的引物组合
为
214
对
,
占所有引物组合的
19.8%
，见表
1
。
2
讨论
新型分子标记
SRAP
有很多特点，如高多态性、
好的重复性、高产率、操作方法简单、均匀分布于
基因组中、扩增得到的目的片段测序容易、引物有
一定的通用性，而且其正反向引物可以相互搭配组
合，用少量引物能组配成多个引物对，使引物的使
用效率提高。
SRAP
标记已在油菜、马铃薯、水稻、
生菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘与芹菜等
(Sun et al.,
2007; Rahman et al., 2008;
王凤涛等
, 2009;
林忠旭
等
, 2003;
杜晓华等
, 2006;
张丽等
, 2007;
张安世等
,
2010;
王刚等，
2004,
中国科学
C
辑
, 34 (6): 510-516)
作物的分子标记研究中，广泛用于种质资源的鉴定
评价、遗传图谱的构建、基因组的转录图谱绘制、
重要性状的基因标记、基因克隆与标记测序。
目前，
SRAP
标记在大豆中应用的报道还比较
少。周春娥等使用
SRAP
标记进行了大豆种质多样
性分析
(
周春娥等
, 2012,
江苏农业科学
, 40(1):
40-42)
。王贤智等
(2008)
利用
SRAP
标记与
SSR
、
AFLP
标记对大豆重组自交系群体进行大豆多态性
标记构建遗传连锁图谱，其中
SRAP
标记的引物为
170
对，亲本间有多态性条带的有
23
对，获得了关
于大豆含油量
QTL SRAP
分子标记
14
个。此外还
获得了
2
个关于叶型和茸毛色的形态标记。但是该
报道称
SRAP
标记应用于大豆扩增效果不理想，重
复性差。因此，在大豆研究中应用
SRAP
标记需要
进行反应体系的优化，建立一个稳定优良有效的
SRAP-PCR
反应体系是十分必要的。
本研究中，进行多次的体系优化，在反应时间
上也进行了多次的校正，反复进行了稳定性与重复
性试验，最后获得了较理想的
SRAP-PCR
反应条件
与反应体，即
20 μL
的反应体系中各组分为：
Mg
2+
浓度为
2.0 mmol/L
，各
dNTP
的浓度
0.20 mmol/L
，
Taq
酶为
1.5 U
，引物浓度为
0.5 μmol/L
，
DNA
为
50 ng
。
在引物筛选上，用
27
条正向引物和
40
条反向引物
组成
1 080
对引物组合，经过筛选和验证，获得
516
对具有多态性的引物组合，这些引物组合可用于分
子标记或进行遗传图谱的构建，
SRAP
分子标记在
大豆研究上应用少，为以后的研究工作节时省力，
提高研究效率提供帮助。
3
材料与方法
3.1
实验材料
用于本研究的材料是经过多年鉴定，对豆卷叶
螟高抗的大豆品种牛黄豆，栾川城关春小黑豆，吴
江青豆
3
，赶泰-
2
-
2
，东兴青皮，丰平黑豆和高感觉
的大豆品种
Morsoy
，
Bethel
，皖
82
-
178
，大浪中团
黄豆，山东大豆，河洲黄豆金龙黑豆，那坡黑眼豆。
3.2
试验方法
3.2.1
总
DNA
的提取
在苗期随机选取新鲜叶片，采用
CTAB
法提取
总
DNA
，用
6%
琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
质量，
RNA/DNA
浓度电度测定仪-
20
℃保存备用。
3.2.2 PCR
扩增引物
根据
SRAP
标记特性进行引物设计，共设计有
正向引物有
27
个，反向引物有
40
个，共组成
1 080
对
SRAP
引物组合，见表
2
，所有引物均是由上海
捷瑞生物工程有限公司合成。
3.2.3 PCR
扩增
以丰平黑豆与
Bethel
为模板，对
Mg
2+
、
dNTP
、
Taq
酶、引物分别设置
5
个不同的浓度梯度，进行
20 μL PCR
反应体系扩增优化。反应过程为：预变
性
94
℃
4 min
，变性
94
℃
50 s
，复性
35
℃
50 s
，
延伸
72
℃
1 min
，循环数是
5
个；变性
94
℃
50 s
，
退火
50
℃
50 s
，延伸
72
℃
1 min
，共
35
循环，循
环后，继续
72
℃延伸
10 min
，产物保存于
4
℃。
3.2.4
产物检测
以丰平黑豆
(
抗
)
与
Bethel (
感
)
等
(
孙组东等
,
2005)
为父母亲本作对照进行
SRAP
分析，检测各引
物组合进行
SRAP-PCR
的有效性。产物中加入
Loading Buffer 3.2 μL
，电泳检测用
8%
非变性聚丙
烯酰胺凝胶，
200V
电压，
0.5
×
TBE
电泳缓冲液，
1 h
电泳，银染显影后，拍照保存。
作者贡献
孙祖东是项目的构思着和负责人，指导实验设计，数
据分析，论文写作与修改；龙继凤、唐兴富、杨微是本实验