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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1080
-
1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1080
-
1086
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1083
图
6
正交设计
SRAP-PCR
反应体系扩增结果
注
: M: DNAMarker DS
TM
5000; 1~16:
处理编号
(
表
3)
Figure 6 Results of SRAP-PCR by orthogonal design on amplification
Note: M: DNAMarker DS
TM
5000; 1~16 are the treatment nunmbers, treatments as that showed in table 3
图
7
引物
me9/em1
对
10
个模板
DNA
的扩增结果
注
: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~10:
模板分别为
W12,
W13, W16, W42, W43, W50, W54, W72, S150, S138
Figure 7 Amplification results of the 10 templates by me9/em1
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~10: DNA were W12,
W13, W16, W42, W43, W50, W54, W72, S150, S138
respectively
图
8 10
个
SRAP
引物组合的扩增结果
注
: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~10:
引物组合分别为
me5
-
em1, me5
-
em8, me6
-
em3, me7
-
em6, me7
-
em8, me9
-
em5,
me9
-
em6, me9
-
em11, me10
-
em1, me10
-
em5
Figure 8 Application results of the ten random primers
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~10: primer pairs were
me5
-
em1, me5
-
em8, me6
-
em3, me7
-
em6, me7
-
em8, me9
-
em5,
me9
-
em6, me9
-
em11, me10
-
em1, me10
-
em5 respectively
2
讨论
影响
SRAP
扩增结果的因素有很多，不同物种
的反应条件各不相同，因此，应用
SRAP
标记时应
该首先对其反应体系进行优化。国内有关
SRAP-PCR
反应体系优化的研究大多仍采用单因素
试验方法，需要进行多次梯度试验，过程繁琐且不
能兼顾到各因素间的交互作用
(
杨珺等
, 2010;
李双
双等
, 2007)
。为了提高分析的准确性，并且获得清
晰、稳定性好、重复性高的
SRAP-PCR
谱带，本试
验首先采用单因素方法确定各因素的浓度范围，降
低单个因素浓度对试验结果的影响，再通过正交设
计的方法，对菊芋
SRAP-PCR
反应体系从
Mg
2+
、
dNTPs
、引物、
Taq
DNA
聚合酶及模板
5
种因素在
4
个水平上进行优化，进一步降低各因素间互作效
应对结果的干扰，从而提高试验的精确性。
在菊芋
SRAP
体系优化的过程中，发现
Mg
2+
、
dNTPs
及模板
DNA
浓度会显著影响
SRAP
扩增效
果，而引物浓度和
Taq
DNA
聚合酶浓度对扩增无显
著影响，优化时可以考虑经济因素等原因选择适宜
的浓度。但本试验优化体系中各组分的用量与菊苣
(
罗燕等
, 2010)
、芦笋
(
盛文涛等
, 2010)
、苎麻
(
刘立
军等
, 2006)
等植物的用量均有不同，这可能是由于
不同植物所用试剂产地及基因组大小不同所致。通
过优化，本课题组成功建立了菊芋
SRAP-PCR
最佳
反应体系，即
20 uL
反应体系中含
10
×
PCR
扩增
缓冲液，
2.5 mmol/L Mg
2+
，
0.24 mmol/L dNTPs
，
0.25 umol/L
正反引物，
0.8 U
Taq
DNA
聚合酶和
80 ng
模板
DNA
，该体系在各菊芋材料和不同的引
物组合中均表现出良好的稳定性、重复性及丰富的
多态性。同时，利用该体系进一步筛选出一批带型
清晰、稳定性强且重复性好的
SRAP
引物对，表明
该优化体系能够满足菊芋
SRAP-PCR
扩增的要求，
同时也能够很好的进行后续实验。目前，本课题组
正在利用该体系开展菊芋种质资源遗传多样性的
研究，已经获得了较好的研究结果。
3
材料与方法
3.1
材料
本试验选用的材料为“青芋
1
号”、“青芋
2
号”、
“青芋
3
号”菊芋及相关菊芋种质资源，种植于青