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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1080
-
1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1080
-
1086
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1082
整条带
(
图
5)
，但随着模板浓度的增加，谱带逐渐清
晰和明亮，当浓度大于
80 ng
时，扩增基本相同，为
节约模板，我们选用模板浓度的范围为
40 ng~80 ng
。
图
3
不同引物浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5:
引物浓度分别为
0.1 μmol/L
、
0.2 μmol/L
、
0.3 μmol/L
、
0.4 μmol/L
、
0.5 μmol/L
Figure 3 Results of SRAP at different primer concentrations
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5: primer concentrations
were 0.1 μmol/L
、
0.2 μmol/L
、
0.3 μmol/L
、
0.4 μmol/L
、
0.5 μmol/L
respectively
图
4
不同
Taq
DNA
聚合酶浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNAMarker DS
TM
5000; 1~5:
Taq
DNA
聚合酶浓度分别
为
0.5 U
、
1.0 U
、
1.25 U
、
1.5 U
、
2.0 U
Figure 4 Results of SRAP at different
Taq
DNA polymerase
concentrations
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5:
Taq
DNA polymerase
concentrations were 0.5 U
、
1.0 U
、
1.25 U
、
1.5 U
、
2.0 U repectively
1.6 PCR
正交试验设计的直观分析
按表
3
设计的
16
个处理以
me9
和
em1
组合作
为引物，对青芋
1
号菊芋基因组
DNA
进行
SRAP
扩
增。从图
6
的电泳结果可以看出，不同组合扩增的
结果存在明显差异。
13
、
14
、
15
和
16
处理扩增条带
少且弱，特异性条带缺失，重复不一致，可能由于
这四个处理相比其它处理
Mg
2+
浓度较高所致。
1
、
2
号处理扩增条带弱，可能由于这两个体系中
PCR
主
要因素的浓度都较低。
4
、
5
、
6
、
8
和
9
号处理扩增
条带有的很弱，有的有不同程度的弥散现象，也有
的特异性条带缺失，可能是这些组合由于正交设计
各个因素梯度的不同，其偏离最优组合比较远，导
致扩增结果不显著。
3
、
7
和
10
号处理两个重复不一
致。
11
和
12
号处理，条带清晰明亮，重复一致，但
12
号处理特异性条带缺失，可能是该处理相对
dNTPs
浓度过大所致。根据扩增谱带的特异性、数
量、亮度的强弱和有无弥散现象进行综合性评价，
11
号处理扩增清晰度高、条带数多、且特异性条带
和非特异性条带对比鲜明，因此可以将其定为最优
组合，即
20 μL
反应体系中含
10
×
PCR
扩增缓冲液，
2.5 mmol/L Mg
2+
，
0.24 mmol/L dNTPs
，
0.25 μmol/L
正反引物，
0.8 U
Taq
DNA
聚合酶和
80 ng
模板
DNA
。
图
5
不同
DNA
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNAMarker DS
TM
5000; 1~5: DNA
浓度分别为
20 ng,
40 ng, 60 ng, 80 ng, 100 ng
Figure 5 Results of SRAP at different DNAconcentrations
Note: M: DNAMarker DS
TM
5000; 1~5: DNA concentrations were
20 ng, 40 ng, 60 ng, 80 ng, 100 ng repectively
1.7
稳定性检测
根据上述优化试验的最终结果，以
me9/em1
引
物组合对不同菊芋种质资源模板
DNA
进行
SRAP-PCR
扩增，结果表明，
10
种菊芋材料均能扩增
出清晰、多态性好的谱带
(
图
7)
。同时，以青芋
1
号
菊芋
DNA
为模板随机选择
10
个
SRAP
引物组合进行
扩增，也得到了较好的指纹图谱
(
图
8)
。由此可见，
优化确定的菊芋
SRAP-PCR
体系具有稳定可靠、重复
性好、多态性较强等特点，可用于菊芋种质资源的分
子鉴定和遗传多样性分析等研究。
1.8 SRAP
引物筛选
以青芋
1
号、青芋
2
号及青芋
3
号菊芋
DNA
为
模板，利用优化的反应体系对表
2
设计的所有
SRAP
引物进行扩增。结果表明：
110
对引物组合均能扩增
出条带，其中
100
对扩增出的谱带清晰稳定且丰富，
所占比率为
90.91%
，说明
SRAP
分子标记有很强的
适用性；本试验共以
3
个菊芋
DNA
为模板能够筛选
出
22
对具有多态性的引物组合，多态率为
20%
，相
对多态性较高。其中，部分引物组合扩增结果见图
9
。