Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1080
-
1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1080
-
1086
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1081
研究尚未见报道。
相关序列扩增多态性
(Sequence-related amplified
polymorphism, SRAP)
是一种新型的基于
PCR
的标
记系统，为显性标记，是由美国加州大学
Li
与
Quiros
博士于
2001
年提出的
(Li and Quiros, 2001)
。
它针对基因外显子
GC
含量丰富而启动子、内含子
AT
含 量 丰 富 的 特 点 来 设 计 引 物 对
ORFs
(openreading frames)
进行扩增，具有简便稳定、重
复性好、产率高、便于克隆目标片段等优点，已广
泛应用于图谱构建、遗传多样性分析等方面的研
究，得到了较满意的结果
(
张俊卫等
, 2011;
李怀志
等
, 2011)
。本研究通过对菊芋
SRAP-PCR
反应系统
中的重要参数先后进行单因子和正交优化，并通过
稳定性检测，成功建立其最佳反应体系，同时为后
续应用该分子标记技术开展菊芋种质资源遗传多
样性等方面的研究奠定基础。
1
结果与分析
1.1 Mg
2+
浓度对
SRAP-PCR
的影响
Mg
2+
浓度显著影响着
SRAP
的扩增效率以及产
物的量和特异性，浓度过低会影响
PCR
扩增产量甚
至导致扩增失败，浓度过高则会降低
PCR
扩增的特
异性。本试验通过比较
5
个
Mg
2+
浓度梯度发现不同
浓度间扩增结果存在显著差异。由图
1
可见，当
Mg
2+
浓度为
1.5 mmol/L
时，扩增条带较弱；当浓度
等于或大于
3.0 mmol/L
时，扩增条带较少且较弱；
当浓度在
2.0 mmol/L~2.5 mmol/L
之间时，扩增条
带较多，谱带清晰，且特异性条带和非特异性条带
对比鲜明，因此
Mg
2+
浓度范围应该选择大于等于
2.0 mmol/L
且小于
3.0 mmol/L
。
图
1
不同
Mg
2+
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5: Mg
2+
浓度分别为
1.5 mmol/L
、
2.0 mmol/L
、
2.5 mmol/L
、
3.0 mmol/L
、
3.5 mmol/L
Figure 1 Results of SRAP at different Mg
2+
concentrations
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5: Mg
2+
concentrations
were 1.5 mmol/L
、
2.0 mmol/L
、
2.5 mmol/L
、
3.0 mmol/L
、
3.5 mmol/L respectively
1.2 dNTPs
浓度对
SRAP-PCR
的影响
dNTPs
作为
SRAP
扩增反应的原料，显著影响
合成效率和扩增的忠实性。由图
2
可见，当
dNTPs
浓度为
0.1 mmol/L
时，扩增产物谱带较弱；当
dNTPs
浓度在
0.15 mmol/L~0.2 mmol/L
时，扩增的条带完
整，且清晰明亮；当
dNTPs
浓度高于
0.25 mmol/L
时，扩增的效果明显减弱，且随着浓度的增加，
特异性条带减少。因此
dNTPs
浓度范围应该在
0.15 mmol/L~0.25 mmol/L
。
图
2
不同
dNTPs
浓度的
SRAP
反应结果
注
: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5: dNTPs
浓度分别为
0.1 mmol/L
、
0.15 mmol/L
、
0.2 mmol/L
、
0.25 mmol/L
、
0.3 mmol/L
Figure 2 Results of SRAP at different dNTPs concentrations
Note: M: DNA Marker DS
TM
5000; 1~5: dNTPs concentrations
were 0.1 mmol/L
、
0.15 mmol/L
、
0.2 mmol/L
、
0.25 mmol/L
、
0.3 mmol/L respectively
1.3
引物浓度对
SRAP-PCR
的影响
引物是
PCR
特异性反应的关键，在退火时与模板
DNA
结合，启动
DNA
扩增。本试验采用相同的上、
下游引物浓度，当浓度为
0.1 μmol/L
时，扩增条带相
对较弱；随着引物浓度的增加，条带渐清晰和稳定，
且扩增结果相差不大，考虑到节约引物的用量，故引
物适宜的浓度范围为
0.2 μmol/L~0.4 μmol/L
。
(
图
3)
1.4
Taq
DNA
聚合酶对
SRAP-PCR
的影响
Taq
DNA
聚合酶是
SRAP
扩增反应的重要参数。
本试验中
Taq
DNA
聚合酶浓度对扩增结果影响不大，
谱带的扩增效果较一致
(
图
4)
。在用量为
1.25 U
时，
扩增条带最为清晰和明亮，其余都有模糊现象，分离
界限不够清晰。因此从经济因素考虑，可供选择的
Taq
DNA
聚合酶适宜浓度范围为
0.5 U~1.25 U
。
1.5
模板浓度对
SRAP-PCR
的影响
模板
DNA
浓度是制约扩增产量及特异性的一个
因素，选择适宜的模板量是保证扩增的重要前提。本
试验通过比较不同模板浓度对扩增结果的影响，结果
显示：在设定的
DNA
模板质量范围内，都能扩出完