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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1001
-
1011
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1001
-
1011
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1004
2000)
。另外，林晓怡等
(2000)
在玉米族远缘杂交组
合
3402F3 (
丹
340×40322)
中首次发现带标记性状的
核雄性不育突变材料，遗传分析表明，其不育性受
一对隐性基因控制，不育基因与多花丝的标记性状
基因完全连锁。
2.1.2
辐射诱变
辐射突变是指利用
χ
、
γ
、
α
、
β
射线和中子、紫
外光等辐射处理生物体，诱发遗传物质的改变，使
后代出现新的变异类型。罗红兵等
(2008)
利用
30Gy
的
7
Li
离子辐射玉米杂交种农大
108
种子，从
M
3
代材料中获得了雄性不育突变材料
39I
3-2
，遗传分
析结果表明，不育材料
39I
3-2
花粉败育彻底，不育
性状表现稳定，呈现出隐性单基因控制的核不育遗
传特点。未辐照的农大
108
的自交后代没有发现雄
性不育现象，从而证明该不育突变体是由重离子辐
射诱导产生的基因突变结果。同时，他们还通过重
离子辐射玉米自交系
478
，经过系统选育从辐射后
代材料中分离获得了细胞质雄性不育材料，进一步
证明重离子辐射作为一种新的诱变育种手段可以
应用于作物遗传改良和种质创新。
2.1.3
太空诱变
太空诱变是指利用太空所特有的环境条件，如
微重力、强宇宙射线、高真空、重粒子、超洁净及
交变磁场等因素，诱发农作物产生的变异类型。曹
墨菊等
(2000)
通过对卫星搭载的
6
份优良玉米材料
的后代进行筛选，从中选育得到了一个隐性核雄性
不育突变体，田间雄花育性表现稳定，花粉彻底败
育，证实为无花粉型不育系。李玉玲等
(2007)
从搭
载神舟
4
号飞船的
4
份玉米自交系后代中选育出了
两个雄性不育突变体，育性鉴定和遗传分析表明，
这两个不育突变体均为无花粉型不育系，雄花败育
彻底。不育性状在不同年份、不同季节、不同地点
可以稳定遗传，属于可遗传的单基因控制的隐性核
不育类型。
2.2
隐性核不育基因的定点突变策略
无论是天然突变，还是人工诱变，都是一种被
动的、低效的技术策略。随着现代分子生物学技术
的发展，科学家发明了多种高效的定点突变技术，
其中最具有代表性的是锌指核酸酶
(zinc finger
nucleases, ZFN)
技术，并且在动植物上都获得了成
功应用
(Wu et al., 2007;
张余洋等
, 2008; Weinthal et
al., 2010;
肖安等
, 2011)
。
ZFN
是一种人工改造的核酸内切酶，包括一个
锌指蛋白
(zinc-finger protein, ZFP) DNA
结合域和一
个非特异性的
Fok
I
剪切结构域
(
图
1A, Kim et al.,
1996)
。其工作原理是
ZFP
能够识别并结合特异的
DNA
序列，与之相连的
Fok
I
随之通过形成二聚体
发挥内切酶的剪切功能，在结合位点附近产生
DNA
双链断裂
(Double-strand break, DSB)
，从而激活非同
源末端连接
(Non-homologous end joining, NHEJ )
或
同源重组
(Homologous recombination, HR)
机制，导
致定点突变或定点置换的发生。当
ZFN
进行基因组
DNA
定点切割时，如果不存在同源性模板，
ZFN
诱导的
DSB
往往通过非同源末端连接，引发基因
定点突变；如果存在一个具有一定同源性的
DNA
为模板，则可以通过同源重组机制实现
DNA
的定
点置换
(
图
1B)
。
ZFN
的
DNA
结合域一般由
3~6
个
Cys2
-
His2
类型锌指蛋白串联而成，每个锌指蛋白识别并特异
结合
DNA
双螺旋的一个单链上的三联体碱基序列。
由多个锌指蛋白串联形成的锌指蛋白组
(Zinc
Finger Array)
，可以识别一段更长的特异碱基靶序
列，从而具有更强的
DNA
结合特异性。每个锌指
蛋白组大约由
30
个氨基酸组成，并折叠成
α
-
β
-
β
型的二级结构，其中
α
螺旋可插入到
DNA
双螺旋
的大沟中，它的-
1~+6
位氨基酸残基决定锌指蛋白
对
DNA
序列的结合特异性。当改变决定
DNA
结合
特异性的氨基酸时，
ZFA
可以获得新的
DNA
结合
特异性
(Dreier et al., 2011)
。因此，
ZFN
不仅具有良
好的
DNA
识别特异性，还具有较好的可塑性，已
成为颇具潜力的
DNA
定点修饰工具。
ZFN
中的非
特异性剪切结构域一般由
Fok
I
核酸内切酶
C
端
96
个氨基酸残基组成
,
而
Fok
I
只有在二聚体状态时
才有酶切活性，从而有效防止
ZFN
单体发挥剪切作
用而造成的脱靶
(off-target)
效应。当两个
ZFN
的
Fok
I
单体分别通过
ZFA
对各自目标
DNA
序列进行特异
结合且在
DNA
双链上形成
5~7 bp
的间隔区时，两
个
Fok
I
剪切结构域二聚体化而发挥酶切活性，对
DNA
间隔区进行定点切割
(
图
1A, Kim et al., 1996;
Miller et al., 2007)
。
ZFN
技术已经在包括玉米在内的多种植物内
源基因的定点修饰上获得了成功应用。
Shukla
等
(2009)
通过
ZFN
技术定点突变了玉米内源基因
IPK1
，同时通过同源重组定向引入
PAT
基因。由于
IPK1
编码一个控制植酸盐生物合成的关键激酶，而