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孙小艳等
, 2011,
杂种马褂木
EST-SSR
引物开发及多态性分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.98 pp.1706-1712 (doi: 10.5376/mpb.cn. 2011.09.0098)
1710
北美鹅掌楸为
5.6% (
胥猛
, 2008)
，橡胶树为
11.42%
(
安泽伟
, 2009)
，甘蔗为
15.15% (
闫学兵
, 2010)
，辣
椒为
3.19% (
张宇
, 2010)
。根据已有的
SSR
标记开发
的报道显示，重复序列越长，
SSR
标记的变异越丰
富
(Gao, 2003; Kantety, 2002)
。因此，本研究选择
Gao
(2003)
的搜索标准，即将不同重复序列的最小长度
定为
18 bp
，结果
16.157 kb
出现一个
SSR
，
SSR
出现
频率为
5.683%
，这个结果与胥猛
(2008)
在北美鹅掌
楸
ESTs
中检索的
SSR
比例
5.6%
相近，高于小麦
(4.7%)
、大豆、玉米
(1.5%)
等基因组中所含的
SSR
频率
(Kantety et al., 2002)
。
而且，与
EST-SSR
的分布特征及频率一样，
EST
中不同重复基序类型
SSR
的频率在不同研究者间也
存在较大差异。已报道的研究显示，大多数植物的
EST-SSR
集中于二核苷酸和三核苷酸重复基序，但
不同的物种主要的重复基序类型仍有所差异。
Gao
等
(2003)
研究表明三核苷酸重复基序在谷类作物基
因组中出现频率最高，但
B
é
rub
é
(2006)
等对火炬松
和云杉的研究却表示在大多数植物基因组中二核苷
酸重复基序占主导地位。本研究出现的
181
个
EST-
SSR
中二核苷酸重复基序出现频率为
58.011%
，占主
导地位，与许多植物结果一致
(
忻雅
, 2006;
胥猛
,
2008;)
。而且，不同重复基序类型出现频率变化很
大，表现出了明显的碱基偏倚性。在杂种马褂木二
核苷酸重复基序类型中，
GA/TC
基序类型数量最
多，占二核苷酸重复基序的
98.095%
，与
Gao (2003)
、
Portis
等
(2007)
、
Wei
等
(2008)
研究结果相似。
Kantety
等
(2002)
分析，由于
GA/TC
基序存在于
(GAG)n
、
(AGA)n
、
(UCU)n
、
(CUC)n
等密码子中，这些密码
子翻译的氨基酸进场在多肽中出现，特别是
Arg
(8%)
和
Leu (10%)
在蛋白质中出现的比例很高，所以
GA/TC
基序在大部分植物的二核苷酸重复基序类
型中出现的频率最高。
本试验证明从杂种马褂木
EST
序列中开发
SSR
标记是可行和高效的，在今后的工作中，我们将利
用获得的
EST-SSRs
引物，通过
EST-SSR
引物的通用
性研究，把这批
SSR
引物应用于杂种马褂木以及鹅
掌楸和中国马褂木的遗传图谱构建、无性系鉴定、
交配系统分析及杂种优势分析等方面的研究，这些
新开发的
EST-SSR
标记必将对马褂木种源收集鉴定、
基因定位、比较基因组学以及标记辅助选择育种等
领域研究起一定作用。此外，实验室也将开发更多
的杂种马褂木
EST
资源以满足
SSR
标记开发的需要。
3
材料与方法
3.1
实验材料和基因组
DNA
提取
实验材料取自江西省高安市生物资源所良种
繁育基地的以马褂木为母本、北美鹅掌楸为父本的
半同胞后代，其中母本马褂木为
1
株来自庐山种源
的成龄优株，北美鹅掌楸花枝来自南京林业大学树
木园优良单株。采用
CTAB
裂解—硅珠吸附法
(Doyle
and Doyle, 1990)
提取植物叶片基因组
DNA
，－
20
℃
低温保存。
3.2 ESTs
数据的微卫星序列检索
杂种马褂木
ESTs
数据来自本实验室构建的杂
种马褂木不定根未剪切均一化
cDNA
文库测序所得
2 921
条非重复序列
(
包括
866
条
singletons
和
2 055
条
contigs)
，利用
SSR Finder
软件对
2 921
条无冗余
EST
序列进行
SSR
搜索，
SSR
标记开发研究表明，重复
序列长度越长，多态性
SSR
标记变异越丰富，所以
搜索标准为精确型重复序列长度不少于
18
个碱基，
即二核苷酸，三核苷酸，四核苷酸，五核苷酸，六
核苷酸的精确
SSR
基序的重复次数最少应为
9
次，
6
次，
5
次，
4
次，
3
次，搜索后对出现的
SSR
频率进行
统计分析。
3.3 EST-SSR
引物设计
在剔除了微卫星两端保守性序列小于
20 bp
的
ESTs
后，利用引物设计软件
Primer5.0
和
oligo6.0
对剩
下的
EST-SSRs
进行引物设计。引物设计的原则是：
引物长度范围为
18~24 bp
；退火温度
Tm
在
50
℃
~62
℃
之间，且上游、下游引物的退火温度相差不大于
5
℃；
(G+C)
含量在
30%~70%
之间；
PCR
扩增片段长
度为
100~300 bp
；尽量避免出现引物二聚体。引物
由上海英骏生物技术有限公司合成。
3.4 EST-SSR
扩增反应体系
PCR
反应体系为
10
μ
L
：
1
μ
L 10
×
Buffe
，
1
μ
L
Mg
2+
2.0 mmol/L
，
0.1
μ
L 1% gelatin
，
0.8
μ
L dNTP
(Datp, dCTP, dGTP, dTTP
各
0.2 mmol/L)
，
0.5
μ
L
各
5 pmol
的上下游引物，
0.05
μ
L 5 U Taq
聚合酶，
1
μ
L
DNA 10~20 ng
，
5.05
μ
L ddH
2
O
。扩增反应程序采用
Touch-down PCR
：
94
℃
15 s
，
62
℃
15 s (
△℃
=