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孙小艳等
, 2011,
杂种马褂木
EST-SSR
引物开发及多态性分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.98 pp.1706-1712 (doi: 10.5376/mpb.cn. 2011.09.0098)
1708
主导地位，特别是二核苷酸重复占总
SSR
的一半以
上，与北美鹅掌楸
(
胥猛
, 2008)
、云杉
(Rungis et al.,
2004)
等植物结果一致，但水稻、大豆、拟南芥等大
多数植物的
EST-SSRs
以三核苷酸重复为主
(Scott et
al., 2000)
。杂种马褂木
EST-SSR
平均长度为
25.22 bp
，
但不同
SSR
的长度存在一定差异，最短
SSR
序列长
度为
18 bp
，最长的为
64 bp
。
1.2
杂种马褂木
EST-SSR
的特性分析
在统计重复基序类型时，我们将基序所有碱基
＋
1
移码序列及其互补序列都视为同一重复基序类
型。如对于二核苷酸重复基序
GA
而言，
GA=AG=
CT=TC
，将这四种二核苷酸重复基序出现的次数之
和作为重复基序
GA
出现的次数；同理，对于三核
苷酸
TCT
，
TCT=CTT=TTC=AGA=GAA=AAG
，用
TCT
来代表这六种类型的重复基序。所以，若
EST-
SSRs
数目足够大并且无偏倚性，四种碱基随机组
合，将产生
2
种单核苷酸类型、
4
种二核苷酸类型、
10
种三核苷酸类型、
33
种四核苷酸类型、
102
种五
核苷酸类型和
305
种六核苷酸基序类型
(Rota et al.,
2005)
。在本研究中，二核苷酸、三核苷酸重复基序
类型占
SSRs
总数的
91.16%
，其他重复基序数量很
少，且重复类型出现的次数一般都是
1
，所以重点
统计二、三核苷酸重复基序类型的分布
(
表
2)
。
表
2 EST-SSRs
序列中不同重复基序出现频率
Table 2 Frequency of different types repeat motifs of EST-SSRs
重复基序类型
重复单元
SSR
数量
频率
(%)
Repeat motif type SSR motif Number of SSR Frequence (%)
二核苷酸
GA/CT
103
98.095
Dinucleotide
GT/CA
1
0.9525
AT/TA
1
0.9525
三核苷酸
AAG/CTT 27
45.0
Ttrinucletide
GCA/CGT 12
20.0
ATC/TAG
5
8.333
TAA/ATT
3
5.0
GAT/CTA
3
5.0
CGG/GCC
3
5.0
AGG/TCC
2
3.333
GAC/CTG
2
3.333
CAC/GTG
2
3.334
ACA/TGT
1
1.667
从表
2
可以看出，杂种马褂木二核苷酸和三核
苷酸重复基序类型的分布状态非常不均匀。在二核
苷酸重复类型的
EST-SSRs
中，含
GA/TC
基序的数量
最多，共
103
个，占二核苷酸重复基序的
98.095%
；
在
60
个三核苷酸重复类型的
EST-SSRs
中，所有的基
序类型都出现了，但分布频率相差较大，
AAG/CTT
基序出现频率最高，共
27
个，占三核苷酸重复基序
数的
45%
，其次为
GCA/CGT (20.0%)
和
ATC/TAG
(8.333%)
，其他重复基序则相对较少，其结果与胥
猛
(2008)
开发的北美鹅掌楸的
EST-SSR
的特征相
似。在二核苷酸重复基序类型中，
GA/AG
基序的数
量占绝对性优势，未发现
CG/CG
基序，并且大部分
的四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复基序类型在
杂种马褂木
EST-SSRs
中都未出现，表现出明显的碱
基偏移性，这与
Jung (2005)
和
Kantety (2002)
等对拟
南芥、玉米、大豆等物种
EST-SSR
的研究结果相符，
在这些植物中也未发现
GC
重复，只在小麦等几个少
数物种中以很低的频率出现过。由此推测，这种
SSR
碱基的偏移性似乎普遍存在于植物中，但因目前获
得的杂种马褂木
ESTs
有限，具体的结论和原因需要
进一步实验研究。
1.3
杂种马褂木
EST-SSR
引物设计和多态性分析
对检索到的
SSR-ESTs
进行分析，剔除掉
SSR
两
端保守序列长度小于
20 bp
的
ESTs
，筛选出了
150
条
ESTs
共
154
个
EST-SSRs
进行引物设计，得到
152
对
EST-SSR
引物
(
表
3)
。
以优良杂种马褂木无性系‘
20
’号的
DNA
样品
以及中国马褂木、北美鹅掌楸为模板，
PCR
扩增结
果显示
152
对引物中有
115
对引物扩增出清晰的条
带，占设计的
EST-SSR
引物总数的
75.5%
。
利用筛选出的有产物的
115
对引物对
8
个杂种
马褂木无性系进行扩增，结果有
61
对引物显示出多
态性
(
图
1)
，占可扩增出产物的引物总数的
53.0%
，
占总设计引物的
40.1%
，呈现出较高的多态性。实
验结果显示，基于
EST
信息建立杂种马褂木多态性
SSR
标记是可行的。
其中，在
61
对表现出多态性的引物中，二核苷
酸重复类型的
SSRs
有
40
个，三核苷酸重复类型
19
个，六核苷酸
2
个，未出现四核苷酸和五核苷酸重
复类型。在二核苷酸重复基序类型中，
GA/CT
重复
基序所占比例为
93%
。