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孙小艳等
, 2011,
杂种马褂木
EST-SSR
引物开发及多态性分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.98 pp.1706-1712 (doi: 10.5376/mpb.cn. 2011.09.0098)
1707
研究背景
随着分子生物学技术的发展，各种分子标记技
术不断出现，如
AFLP
、
RAPD
、
SSR
、
SNP
等，大
大提高了科研人员对各种动植物进行遗传分析研究
的能力，其中
SSR (
即简单重复序列或微卫星
DNA)
因其重复性好、标记共显性、孟德尔遗传、多态性
丰富等优点，在动植物遗传研究中应用非常广泛。
SSR
标记可分为基因组
SSR
和
EST-SSR
。传统的
基因组
SSR
标记开发过程非常繁琐，需要进行基因
组文库构建、重复序列克隆识别和筛选、测序、引
物设计等环节，不仅费时耗力，成本也很高。
EST-
SSR (expressed sequence tag based simple sequence
repeat)
是在
EST (
表达序列标签
)
基础上发展起来的
一种新的标记方法，它是在搜索
EST
中微卫星的基
础上，根据微卫星侧翼已知序列设计引物，与传统
基因组
SSR
标记开发相比，可直接获得基因表达转
录信息，其多态性可能与基因的功能直接相关，可
对决定重要表达性状的等位基因进行筛选、鉴定，
强化
EST-SSR
在遗传学领域研究中的应用；而且在
相近的物种间具有良好的通用性，不需进行文库构
建、克隆、测序等复杂步骤，大大降低开发利用成
本。
EST-SSR
标记开发因其快速、高效等特点已广
泛应用于小麦、大麦、水稻、玉米、拟南芥、黑麦
草、葡萄、杨树、松树、杉木等植物的
SSR
标记开
发。如
Kantety
等
(2002)
对玉米、水稻、小麦等
5
个物
种
262 631
条
EST-SSR
序列进行分析，发现了
8 514
条
EST-SSRs
；陈海梅等
(2005)
利用
151 695
条小麦的
EST
序列发现了
2 038
个
SSR
序列；杨素丽等
(2008)
利用
NCBI
上的
1 688
条百合
EST
开发出
101
个
SSR
标记。
杂种马褂木
(
L. chinense
Sarg.
×
L. tμlipifera
L.)
为马褂木与北美鹅掌楸的杂交后代，由南京林业大
学已故林木育种学家叶培忠教授于
1963
年首次杂
交成功。杂种马褂木杂种优势明显，具有生长迅速，
干形良好，花叶奇特，抗逆性强，适应性广等优良
特性，是珍贵的工业用材及高档家具用材树种，也
是优良的园林绿化树种
(
王章荣
, 2005)
，已逐渐在我
国福建、浙江、江苏、江西、湖南、湖北、河南、
山东、北京和陕西等地试种推广，表现出良好的发
展潜力。国内有众多研究者对其开展了大量研究
(
李
火根和施季森
, 2009,
林业科技开发
, 23(3): 1-5;
黄
利斌
, 2008)
，并逐步将分子标记技术
(
主要是
RAPD,
SSR)
运用于杂种马褂木的遗传研究
(
孙亚光和李火
根
, 2007;
张红莲
, 2010)
，但这些研究所用的
SSR
标
记大部分都是胥猛等
(2008)
从北美鹅掌楸中开发的
EST-SSRs
，国内外研究者还从未从杂种马褂木基因
组中开发
SSR
标记。因此，从杂种马褂木中开发
EST-SSR
标记对开展杂种马褂木遗传多样性分析、
优良无性系鉴定以及杂种优势的机理分析等方面
的研究具有重要意义。
1
结果与分析
1.1
杂种马褂木
EST-SSRs
频率分析
本研究对杂种马褂木不定根
cDNA
文库测序获
得的
2 921
条无冗余
ESTs
序列中的
2~6
核苷酸重复类
型进行精确型
SSR
检索，在
166
条
ESTs
发现
181
个
SSRs
，占全部
ESTs
的
5.683%
，这个结果与胥猛
(2008)
在北美鹅掌楸
ESTs
中检索的
SSR
比例
5.6%
相近，高
于小麦
(4.7%)
、大豆、玉米
(1.5%)
等基因组中所含
的
SSR
频率
(Kantety et al., 2002)
，表明在杂种马褂木
基因组中含有较丰富的
SSR
。检索的
ESTs
序列全长
2 924 386 bp
，即平均每
16.157 kb
出现一个
SSR
。在
166
条含有
SSR
的
ESTs
中，
151
条
EST
含有
1
个
SSR
，
15
条
EST
含有
2
个
SSR
。检索到的
EST-SSR
类型丰富，
从二核苷酸至六核苷酸重复都有发现，但频率相差
较大，二核苷酸重复基序类型出现频率最高，而四、
五核苷酸出现频率明显偏低
(
表
1)
。可见，在杂种马
褂木
EST-SSRs
中，二核苷酸和三核苷酸重复基序占
表
1 EST-SSR
重复核苷酸数数量及频率
Table 1 Number and frequency of repeat types in EST-SSR
重复类型
数量
占全部
SSR
比例
(%)
频率
(%)
Repeat type
Number Percent of total EST-
SSRs (%)
Frequence
(%)
二核苷酸
105
58.011
3.595
Dinucleotide
三核苷酸
60
33.149
2.054
Trinucletide
四核苷酸
5
2.766
0.171
Tetranucletide
五核苷酸
2
1.105
6.847×10
-4
Pentanucletide
六核苷酸
9
4.972
0.308
Hexanucle otide
总计
181
100
6.196
Total