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王爱香等
, 2011,
火鹤
胚状体诱导与发生过程中愈伤组织细胞学观察
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.97 pp.1700-1705 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0097))
1701
变等缺点；若结合液体悬浮培养或生物反应器，繁
殖数量多，速度快，结构完整；重现胚胎发生途径，
生理年龄较小，再生苗质量更高；再生系统遗传上
稳定、再生频率高，是理想的遗传转化系统
(
沈海龙
,
编著
, 2003,
植物组织培养
,
中国林业出版社
, pp.109)
。
因此，研究火鹤胚状体诱导与发生对于火鹤商品化
种苗生产及构建遗传转化系统具有重要价值。目前，
国内外有一些关于火鹤胚状体诱导与成苗的研究报
道。最早
Kuenule
以火鹤叶片为外植体，采用较低浓
度的
2,4
-
D
与
BA
，观察到了疑似胚性愈伤组织的形
成，并从该愈伤组织再生出小苗，但该小苗是否通
过胚状体成苗还不能确定
(Kuennle and Sugii, 1991)
；
第
2
年
Kuenule
采用较高浓度
2,4
-
D (2~4 mg/L)
与
KIN
配合诱导出胚状体并成苗
(Adelheid et al., 1992)
。后
来的学者主要研究火鹤体细胞胚状体诱导和发生
过程中的培养条件的优化。例如，
Prakash
研究发现
Nitsch
培养基中添加椰子汁、香蕉汁等天然复合物
能促进火鹤胚状体发生
(Prakash et al., 2002)
，辛伟
杰研究发现在改良
MS
培养中添加高浓度
2,4
-
D
和较
低度
BA
有利于火鹤体细胞胚状体的诱导
(
辛伟杰等
,
2006)
，而
Beyramizade
研究认为改良
MS
培养中添加
高浓度
2,4
-
D
和较低度
KIN
有利于火鹤体细胞胚状
体的诱导
(Beyramizade et al., 2008)
。目前对火鹤胚
状体发生的细胞学观察少有人研究。由于不定芽和
胚状体发生都要经过一个愈伤组织发生阶段，何种
愈伤组织再生不定芽或胚状体，完全凭研究者或生
产者经验，缺乏科学性；甚至有人在火鹤组培诱导
的愈伤组织中既观察到了不定芽的再生又观察到
了胚状体的再生
(
赵云鹏等
, 2005)
。因此，开发火鹤
体细胞胚状体发生的形态标记
(
肉眼观察愈伤组织
形态结构
)
、细胞学标记
(
显微观察胚状体发生
)
和分
子标记
(
胚性细胞激发和胚状体发育的标记基因等
)
的关联体系，对于科学指导火鹤胚状体诱导与发
生、指导火鹤胚状体种苗生产具有重要意义。本论
文主要研究细胞学标记与形态学标记的关联，并以
此区别胚状体诱导阶段和发生阶段，有助于了解火
鹤胚状体诱导与发育的细胞学机理，并能为后续研
究中寻找相关阶段分子标记物提供依据。
1
结果与分析
1.1
愈伤组织诱导及继代培养结果
接种后
2~3 d
外植体由平铺变为向上鼓起，切口
处变为黑色。接种后
20 d
少数外植体切口处黑色部
位变得不连续。接种后
1
个月伤口处变为乳白色，
叶脉切伤处可见连成片的乳白色愈伤，主脉切口处
最为明显。
1
个半月后愈伤逐渐长大成块，外植体
诱导
2
个月的愈伤组织团为浅黄褐色略带红色，蓇
葖状
(
图
1
-
1)
。加有不同浓度激素的培养基中的愈伤
诱导率不同，其中
A4
、
A5
、
A6
等
3
种培养基中获得
较高的愈伤诱导率
(
表
1)
。
将上述愈伤组织切割成小块后接种于
1/2MS
+1.0 mg/L 6
-
BA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA
上继
代培养。培养
10 d
后，愈伤组织增殖，并出现绿色
芽点；
20 d
后，愈伤组织上出现大量红色叶鞘包被
的绿色不定芽，较大的愈伤组织块周围长出浅黄色
或者黄绿色胚性愈伤
(
图
1
-
2)
；
1
个月后，芽持续生
长，胚性愈伤组织也进一步膨大
(
图
1
-
3)
。
图
1
火鹤胚状体诱导过程中愈伤组织诱导及继代培养
注
: 1:
叶片在加有
2,4
-
D
的培养基上诱导出的愈伤组织
; 2:
愈伤组织继代培养
20 d
后长出不定芽和新的愈伤组织
; 3:
愈伤组
织继代培养
30 d
后长出不定芽和新的愈伤组织
; 4:
启动培养获得的愈伤组织
; 5:
继代培养新长出的胚性愈伤组织
Figure 1 Callus induction and subculture during the Anthurium andraeanum's embryoid induction
Note: 1: The induced callus from leaves on the media supplemented with 2,4
-
D; 2: Adventitious shoot and new callus after twenty
days' subculture 3: Adventitious shoot and new callus after thirty days' subculture; 4: The acquired callus after primary culture; 5:
The Acquired embryonic callus after subculture