Basic HTML Version
孙晓宇等
, 2011,
不同保存
条件下五种大型海藻的
DNA
提取和
PCR
分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.95 pp.1680-1691 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0095)
1690
表
5
大型海藻样品信息
Table 5 The information of seaweed sample
样品名称
采集地
采集时间
Sample name
Collection site
Collection time
海带
山东荣成
2009.5
Laminaria japonica
Rongcheng, Shandong
亨氏马尾藻
广东汕头
2009.2
Sargassum henlowianum
Shantou, Guangdong
龙须菜
广东汕头
2009.2
Gracilaria Lemaneiformis
Shantou, Guangdong
长心卡帕藻
海南陵水
2009.5
Kappaphycus alvarezii
Lingshui, Hainan
浒苔
江苏如东
2009.10
Enteromorpha prolifera
Rudong, Jiangsu
PCR
中所用引物由博尚生物工程有限公司合
成，
MgCl
2
、
PCR Buffer
、
dNTP
、
Taq
DNA
聚合酶
购自
TAKARA
宝生物工程
(
大连
)
有限公司。其他药
品购自上海国药集团，均为分析纯。
3.3
样品制备
(1)
对照组：新鲜的活体样品。
(2)
实验组：藻体用消毒海水冲洗干净后，用吸
水纸吸干表面水分，每组样品称取
2
份，每份
1 g
，
处理条件如下：
a
．硅胶干燥：将藻体放入
10 g
硅胶中，用密封
塑料袋装好。在常温下进行干燥。
b
．恒温干燥：将藻体放于培养皿中，放于电
子防潮柜内进行干燥。
c
．压标本法干燥：将藻体放于多层吸水纸间，
用铁夹固定，在常温下放置。每隔
24 h
更换一次吸
水纸。
d
．高温干燥：将藻体放于培养皿中，在烘箱
内分别进行
45
℃，
75
℃烘干处理至脱水。
e
．冷冻干燥：将样品用低温冷冻干燥仪进行
干燥，至脱水。
f
．低温储存：将样品密封在样品袋中，分别在
4
℃、-
20
℃、-
80
℃冰箱内进行保鲜储存。
恒温干燥、高温干燥、冷冻干燥法处理样品至
干燥后，用保鲜膜密封，放置于-
20
℃冰箱保存。
样品保存时间均为
2
个月。
3.4 DNA
提取方法
参照
Lichtenstein
和
Draper (1985)
的
CTAB
法稍
作调整。利用
0.2% (v/v) β
-巯基乙醇抑制样品中酚
类物质的氧化，并利用两个浓度的
CTAB (2%
和
10%)
与多糖等杂质结合。
3.5 DNA
的质量检测
提取的
DNA
经
1%
琼脂糖凝胶电泳并用
JS-380A
型凝胶成像系统检测所得
DNA
的完整性，
用
Thermo Scientific NANODROP 1000
分光光度计
测定
DNA
浓度及
OD260/OD280
比值，并计算得率。
3.6 PCR
分析
以提取的
DNA
为模板，分别利用
rbc
L
、
cox
Ⅰ
引物进行核外基因的扩增，同时利用
2
对
SRAP
引物
进行扩增。
rbcL PCR
扩增引物、反应程序和反应体系参考
Lane
等
(Lane et al., 2006)
，所用引物为
KL2 (5'
-
GAT
GCTGATTATAACGTTAAAG
-
3')
；
KL8 (5'
-
GTTGG
TGCATTTGACCACA
-
3')
。
cox
Ⅰ
PCR
扩增引物、反应程序及反应那个体
系参照
Folmer
等
(Folmer et al., 1994)
，所用引物为
LCO1490 (5'
-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA
TCA
-
3')
；
HCO2198 (5'
-
GGTCAACAAATCATAAA
GATATTGG
-
3')
。
参考
Qiao
等
(Qiao et al., 2000)
的两对引物组合
进行
SRAP PCR
扩增，其引物分别为
ME1 (5'
-
TGAG
TCCAAACCGGATA
-
3')
，
EM3 (5'
-
GACTGCGTAC
GAATTGAC
-
3')
；
ME3 (5'
-
TGAGTCCAAACCGGA
AT
-
3')
，
EM2 (5'
-
GACTGCGTACGAATTTGC
-
3')
。
两对引物组合反应体系相同，为
20 μL
，内含模板