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孙晓宇等
, 2011,
不同保存
条件下五种大型海藻的
DNA
提取和
PCR
分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.95 pp.1680-1691 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0095)
1689
图
5
不同保存样品的
DNA
的
cox
Ⅰ扩增结果
注
: 1~4:
海带活体、冷冻干燥、低温储存
(
-
20
℃
,
-
80
℃
)
样品
;
5~8:
龙须菜活体、冷冻干燥、低温储存
(4
℃
,
-
20
℃
)
样品
;
9~12:
长心卡帕藻活体、压标本法干燥、冷冻干燥、低温储
存
(
-
20
℃
)
样品
; 13~16:
浒苔活体、低温储存
(4
℃
,
-
20
℃
,
-
80
℃
)
样品
; M: DNAMarker
Figure 5
cox
Ⅰ
results with different storing sample methods
Note: 1~4: sample of
L. japonica
; 5~8: sample of
G.
Lemaneiformis
; 9~12: sample of
K. alvarezii
; 13~16: sample of
E. prolifera
; M: DNAMarker
取
DNA
的产量和质量有很大影响。本研究探讨了
5
种大型海藻分别在
6
种保存方法处理后的
DNA
提取
效率，除高温干燥样品外均得到了较完整的
DNA
。
藻类样品含水量非常高，较长时间的高温干燥过程
极易使样品的组织结构及化学物质发生变化，对样
品的损害较大，因此影响了
DNA
提取效果，不适合
作为藻类样品的干燥保存手段。冷冻干燥法和恒温
干燥法需要有相应的干燥设备对新鲜样品及时进
行干燥处理，不适合海藻材料采集现场保存；低温
储存法可以作为样品短期
(4
℃
)
和长期
(
-
20
℃
,
-
80
℃
)
保存手段。相对而言，压标本干燥法和硅胶
干燥法非常适用于采集地点多、相距远、野外采集
时间长、所采样品的种类和数目多的遗传多样性研
究，另外压标本干燥法比硅胶干燥法更简单、方便，
而且可以更好地保存样品的形态特征，有助于样品
的后期分类鉴定。
2.2
不同保存方法样品提取
DNA
的
PCR
扩增检测
评价
样品
DNA
的质量会对分子遗传分析结果的可
靠性和稳定性产生影响，本研究提取的为大型海藻
总
DNA
，可用于核基因组和细胞质基因组的研究。
除高温干燥保存样品的
DNA
扩增结果不稳定外，其
它不同条件下保存样品的
DNA
在经过扩增
(2
对
RSAP
引物
, 1
对
rbc
L
引物和
1
对
cox
Ⅰ引物
)
均得到了
与对照组
(
新鲜样品
)
相同的产物带型。
综上几种
PCR
扩增的结果显示，样品在高温干
燥保存条件下扩增结果不稳定，其它保存条件下样
品所提
DNA
，扩增结果稳定并且
PCR
扩增检测结果
与对照组
DNA
无明显差别，可用于核基因组、线粒
体及叶绿体基因组的分子遗传学研究。
2.3 DNA
提取方法评价
从顽拗植物中提取高质量
DNA
的难度较大，科
研工作者对各种顽拗植物的
DNA
提取方法进行了
大量的探索工作。目前报道的藻类
DNA
提取方法有
改良的
CTAB
法
(
沈晓岚等
, 2009)
，试剂盒法
(
韩静等
,
2008)
，氯化锂法
(Hong et al., 1995)
，
SDS
法，
NaHSO
3
法，
NaOH
法
(
沈晓岚等
, 2009)
等多种方法。改良后
的
CTAB
法即能裂解细胞又能有效地沉淀多糖，对于
多糖类物质含量高的材料较使用。沈晓岚等
(
沈晓岚
等
, 2009)
对不同属的观赏凤梨叶片用多种方法提取
DNA
并进行了比较，结果显示
CTAB
法所得
DNA
得
率及质量均为最优。韩静等
(
韩静等
, 2008)
比较了改
良的
CTAB
法、
LiCI
法及试剂盒法在三种海藻材料
中抽提基因组
DNA
的效率，改良的
CTAB
法相对于
试剂盒法得率要高，相对于氯化锂法等质量要好。
大型海藻中普遍富含蛋白质，但不同种属藻类
含有的胶类物质不同，绿藻中果胶含量高，红藻中
富含琼胶或卡拉胶，褐藻中褐藻胶含量丰富，且各
类海藻均含有较多的酚类物质。本实验中涉及的
5
种大型海藻采用统一的改良
CTAB
法均取得了良好
的
DNA
提取效果，
5
种海藻的活体样品平均得率为
56.7 μg/g
，制作成标本的样品在标本制作过程中可
能受到部分影响，
DNA
提取难度相对较大，标本样
品平均得率为
39.4 μg/g
，但相对于
SDS
法、
LiCI
法、
试剂盒法等在多种藻类和高等植物的得率仍处于
较高水平，充分显示了改良
CTAB
法在不同物种中
较高的适用性，同时
CTAB
法操作相对简便，成本
较低，是大型海藻样品理想的
DNA
提取方法。
3
材料与方法
3.1
实验材料
实验所用活体大型海藻由中国海洋大学大型
海藻种质库提供
(
表
5)
。
3.2
主要试剂
CTAB
提取缓冲液：
100 mmol/L Tris-HCl
(pH8.0)
，
20 mmol/L EDTA
，
1.4 mol/L NaCl
，
2%
CTAB
，
3% PVP
，
2% (v/v)
；
β
-巯基乙醇；氯仿
:
异
戊醇
(24:1)
；酚
:
氯仿
:
异戊醇
(25:24:1)
。