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刘娜等
, 2011,
苹果茎痘病毒梨
分离物外壳蛋白基因的克隆与分子变异分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.92 pp.1653-1661 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0092)
1659
使用的
PS/PA
是有效扩增
CP
基因完整编码区的引
物。通过大量样品扩增发现，库尔勒香梨、鸭梨、
砀山梨这三个品种的样品中，库尔勒香梨和鸭梨均
扩增出了预期目的片段，测序结果证明是
ASPV CP
基因。本研究扩增出了库尔勒香梨
KL1
和
KL9
及
鸭梨
Y3
的
3
个分离物
CP
基因，基因片段大小均
为
1 194 bp
，编码
397
个氨基酸，分子量约为
42 kDa
。
将序列提交至
GenBank
，登录号分别为
JF946775
、
JF946773
、
JF946774
。而砀山梨的
6
个样品均没有
扩增出目的片段，但用
ASPV
复制酶保守区引物扩
增出了目的片段，并通过目的片段测序证明这些样
品均感染了
ASPV
。因此，应该在不同生态环境和
地理区域采集更广泛的寄主研究外壳蛋白基因的
分子变异，以便能系统的了解
ASPV
外壳蛋白的变
异特征及株系分化情况。
实验结果显示，我们扩增得到的
3
个
ASPV
分
离物的
CP
基因与
GenBank
上登录的序列的氨基酸
的同源率一般均在
70%
左右。
aa1
-
177
氨基酸序列
出现较大变异，为高变区，而后
130
个氨基酸高度
保守。外壳蛋白在保护病毒核酸的同时，在病毒侵
染过程中还起着识别寄主的作用，而蛋白质功能位
点往往是由较短的序列片段组成，此区域序列一般
具有较强的保守性
(Meng et al., 1998; Hull, 2001)
。
对其氨基酸序列位点扫描发现，
CP
基因的识别位
点主要分布在高度保守区，分别为：
Cys
位于
aa292
，
ProProXXTrp
位于
aa309
-
313
，
AryXPheAspPhe
位
于
aa325
-
329
及
Pro
位于
aa349
，这些位点是外壳蛋
白基因的活性和识别位点，可能还执行其它重要的
生理功能。因此，有关位点及变异区域的研究，对
搞清
ASPV CP
基因的结构功能及其变异特征具有
重要的意义。
分子生物学技术在植物病毒分类及病毒株系
鉴定中的应用，使得界定植物病毒的地位或株系种
类更具准确性和科学性
(Li et al., 2006)
。随着分子生
物学技术的不断进步，利用病毒序列来研究病毒的
演化已成为可能，用其构建系统进化树可以准确了
解病毒株系的亲缘关系及演化趋势
(Chachulska et
al., 1997)
。对
ASPV
来说，由于目前报道的全长基
因组序列仅有
4
条，对该病毒的分类及株系分化带
来了一定困难，而病毒的
CP
基因在寄主症状、病
毒长距离和细胞间运转、病毒的介体传播等方面起
着重要作用，同时，病毒间
CP
基因的同源性比较
分析是病毒株系划的主要依据之一，因此，本实验
对
3
个新疆分离物的
CP
基因与
GenBank
上登录的
25
个完整的
CP
基因氨基酸序列进行了系统进化分
析，结果显示，这些分离物分类聚集的趋势十分明
显，呈现一定的寄主相关性，该结果与李丽丽等
(2010)
报道的结果相同。本试验研究结果显示，
28
个分离物共分为
3
个类群，一是以苹果为寄主的类
群，二是以梨为寄主的类群，三是以新疆栽培的梨
品种为寄主的类群。图
4
显示，新疆栽培的梨品种
自成一个类群，第一和第二类群中小的进化分支的
形成并不具有一定的规律性，这可能是由于生态环
境的改变，引起了病毒外壳蛋白基因的变异。从表
1
可以看出，
25
个分离物大多为中国和波兰分离物，
这给进化关系的分析带来一定局限性。病毒也同其
它生物一样，由于自然选择压力的存在，当自然环
境改变时，为了适应环境而不断地发生变异，基因
组结构和序列能真实反映植物病毒的变异及进化
关系
(
古勤生等
, 2008)
，如能将不同地理来源，不同
气候条件的分离物的
CP
基因与基因组的其它序列
信息结合起来分析，则会使
ASPV
分类更加全面。
3
材料与方法
3.1
材料
3.1.1
植物材料
本实验所用植物材料均采自新疆库尔勒沙依
东园艺场香梨园，采集库尔勒香梨、鸭梨和砀山梨
的一、二年生枝条，并放入
4
℃保存备用。
3.1.2
主要试剂和菌株
Taq
DNA
聚合酶购自广东东盛生物科技有限
公司；
Ribonuclease Inhibior
、
dNTPs
、
IPTG
、
X-Gal
购自上海生工生物技术有限公司；
DNA Marker
D514A
、
PMD19
-
T vector
均购自大连宝生物有限公
司；反转录酶
M-MLV
、限制性内切酶购自
Fermentas
；
其它常规试剂均为国产分析纯。菌株
E. Coli
DH5α
由石河子大学农学院果树生物技术实验室保存。
3.1.3
引物设计
根据
GenBank
上已提交的
ASPV
全长基因组序
列
(
登录号
: NC_003462)
，通过
Primer 5.0
软件设计扩
增
CP
基因的全序列引物。引物序列为：上游引物
(PS)
5'
-
CCCATTAGGTTAGGGTGTAGTTGCT
-
3' (
位于
nt7829
-
7853)
；下游引物
(PA) 5'
-
ATGAAAGAA
ACACACACATAGCCGC
-
3' (
位于
nt9249
-
9273)
。引
物由上海生工生物技术有限公司合成。