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刘娜等
, 2011,
苹果茎痘病毒梨
分离物外壳蛋白基因的克隆与分子变异分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.92 pp.1653-1662 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0092)
1660
3.2
方法
3.2.1
总
RNA
的提取
利用皮层为材料提取总
RNA
，具体参考何梅等
(2004)
库尔勒香梨总
RNA
快速提取方法。
3.2.2
苹果茎痘病毒的
RT-PCR
扩增
cDNA
第一链的合成：反转录体系为
25 μL
，含
总
RNA 5 μL
、
DEPC
水
9.5 μL
、反向引物
1 μL
；
70
℃
水浴
5 min
，冰浴
5 min
；再依次加入
M-MuLV 5
×
buffer (Mg
2+
40 mmol/L) 5 μL
、
dNTPs (10 mmol/L)
2.5 μL
、
RNasin (40 U/μL) 1 μL
；
42
℃水浴
5 min
，最
后加入
M-MuLV 1 μL
。反应条件为
42
℃水浴
1 h
，
92
℃灭活
4 min
，然后置于冰上进行
PCR
反应或
-
20
℃保存待用。
PCR
扩增
PCR
反应体系：
10
×
Buffer 2.0 μL
(
含
Mg
2+
)
、
dNTP 0.4 μL
、引物
PS/PA (20 μmol/L)
各
1 μL
、
cDNA 2.0 μL
、
Taq
聚合酶
0.2 μL
，总体积
20 μL
。
PCR
扩增程序为：
94
℃预变性
4 min
，
32
次循环：
94
℃
45 s
，
57
℃
45 s
，
72
℃
1 min
，最后
72
℃ 延伸
7 min
。
3.2.3 PCR
产物电泳检测
取上述
PCR
产物
5 µL
，用
1.2%
的琼脂糖凝胶，
溴化乙锭
(EB)
染色，进行电泳鉴定，电泳缓冲液为
1
×
TAE
，电压
150 V
，紫外灯下观察实验结果并
照相记录。
3.2.4
目的片段克隆、测序和序列分析
PCR
产物经切胶回收纯化后与
PMD19
-
T
载体
连接，转化大肠杆菌
DH5α
，通过抗性筛选，将质
粒
PCR
、酶切鉴定都正确的插入片段的菌液寄往上
海生工生物技术有限公司进行测序。测序结果同源
性分析采用
DNAMAN
软件，氨基酸的多重比对使
用
CLUSTAL-X (version 1.81)
分析软件，系统进化
树采用
CLUSTAL-X (version 1.81)
和
MEGA (version
4.1)
分析软件。
作者贡献
刘娜是本研究的实验设计和实验研究的执行人，同时完
成数据和试验结果分析，论文初稿的写作；牛建新是项目的
构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修
改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金资助项目
(30360066)
；国家
科技攻关计划引导项目
(2003BA546C)
；石河子大学自然科学
与技术创新项目
(ZRKX200707)
的资助。作者感谢两位匿名
的同行评审人的评审建议和修改建议。本文中提到了我们实
验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这
些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。
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