Basic HTML Version
刘娜等
, 2011,
苹果茎痘病毒梨
分离物外壳蛋白基因的克隆与分子变异分析
,
分子植物育种
(online) Vol.9 No.92 pp.1653-1661 (doi: 10.5376/mpb. cn.2011.09.0092)
1654
登录号为
AB045371 (Yoshikawa et al., 2001)
；中国
分离物
PR1
，登录号为
EU095327
和印度分离物
Palampur
，登录号为
FR694186
。而有关
ASPV CP
基因的完整编码序列或部分序列已有来自不同国
家和地区的很多报道。现有的基因组序列和部分序
列已表明
ASPV
不同分离物存在着复杂的分子变
异。因此，非常有必要系统开展
ASPV
的分子变异、
遗传进化和株系分化研究。但目前国内外报道的
ASPV
全长基因组序列仅有
4
条，利用这
4
条序列
开展
ASPV
的遗传进化及分子变异研究尚存在一定
局限性。
Nemchinov
等
(1998)
采用
PCR
技术检测了
不同寄主的
ASPV
，同时对不同分离物进行了序列
分析；
Schwarz
和
Jelkmann (1998)
检测了欧洲梨和
苹果分离物的
ASPV
，进行了外壳蛋白基因的序列
分析。分析结果均表明
ASPV
不同分离物间存在变
异。然而国内外关于
ASPV CP
基因分子变异及遗
传进化研究方面系统报道较少，因此，利用外壳蛋
白基因序列开展分子变异研究十分必要。通过了解
病毒变异规律及株系分类情况，明确病毒变异特点
对更好的认识病毒和控制病毒具有重要意义。本研
究分别从新疆库尔勒地区香梨园中采集库尔勒香
梨、鸭梨、砀山梨等主要栽培品种，通过对
ASPV CP
基因不同分离物的克隆及详细的序列分析，以明确
其分子变异规律和分类特点。
1
结果与分析
1.1ASPV CP
基因的
RT-PCR
扩增
以感染
ASPV
的库尔勒香梨
KL1
、
KL9
、鸭梨
Y3
及砀山梨的枝条韧皮部为试材，将提取的总
RNA
反转录合成
cDNA
第一链后，利用设计的引
物
PS/PA
进行
RT-PCR
扩增，
KL1
、
L9
、鸭梨
Y3
分别扩增出了预期片段，大小为
1 392 bp
，包含了
完整的
CP
基因。感染
ASPV
的砀山梨没有扩增出
目的片段
(
图
1)
。
1.2 ASPV
外壳蛋白基因的克隆与鉴定
RT-PCR
产物经回收纯化后连接到
PMD19
-
T
带有抗氨苄青霉素
(Amp
r
)
抗性的载体上，热击转化
大肠杆菌
DH5α
。通过含有
Amp
、
X-gal
和
IPTG
的
LB
培养基
37
℃培养
12 h~16 h
，进行蓝白斑筛选。
挑取白色菌落，振荡培养后，用裂解法小量提取重
组质粒
DNA
，做重组质粒的
PCR
及酶切鉴定
(
图
2)
。
将鉴定正确的质粒菌液送往上海生工生物技术有
限公司测序。
图
1 ASPV CP
基因的
RT-PCR
检测
注
: M: DNA
分子标量
;
泳道
1: KL1;
泳道
2: KL9;
泳道
3:
Y3;
泳道
4:
阴性对照
Figure 1 Detection of ASPV CP gene by RT-PCR
Note: M: DNA marker; Lane 1: KL1; Lane 2: KL9; Lane 3: Y3
RT-PCR product; Lane 4: Negative control
图
2
重组质粒的
PCR,
酶切鉴定
注
: M: Mark;
泳道
1: KL1;
泳道
2: KL9;
泳道
3: Y3;
泳道
4: KL1
单酶切
;
泳道
5: KL1
双酶切
;
泳道
6: KL9
单酶切
;
泳
道
7: KL9
双酶切
;
泳道
8: Y3
单酶切
;
泳道
9: Y3
双酶切
Figure 2 Identification of recombined plasmid by PCR and
Restriction enzyme
Note: M: Mark: Lane 1: KL1; Lane 2: KL9; Lane 3: Y3; Lane
4: KL1 signal enzyme-digested; Lane5: KL1 double enzyme-
digested; Lane 6: KL9 signal enzyme-digested; Lane 7: KL9
double enzyme-digested; Lane 8: Y3 signal enzyme-digested;
Lane 9: Y3 double enzyme-digested
1.3 ASPV
外壳蛋白基因的序列测定
测序分析结果表明，
3
个分离物
(KL1
、
KL9
、
Y3)
的
ASPV
外壳蛋白基因片段大小均为
1 194 bp
，
编码
397
个氨基酸，分子量约为
42 kDa
。将序列提
交至
GenBank
，登录号分别为
JF946775
、
JF946773
、
JF946774
。
ASPV CP-KL1
中含有
316
个
A
，
292
个
T
，
293
个
G
和
293
个
C
，各碱基在
CP
基因中的百
分含量分别为
26.3%
、
24.5%
、
24.5%
和
24.5%
；
ASPV
CP-KL9
中含有
314
个
A
，
291
个
T
，
296
个
G
和