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孟衡玲等, 2011, 三种提取铁皮石斛叶片总 RNA 方法的比较, 分子植物育种 Vol.9 No.83 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0083)
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1.2 PCR 扩增
对三种方法提取的 RNA 反转录成 cDNA，用
F1 和 R1 特异引物进行 PCR 扩增，扩增结果( 图 2)，
第三种方法提取的 RNA 质量最好， PCR 扩增出的
条带最清晰，其次是试剂盒法，而普通 TRIZOL 法
没有扩增出条带。
图 2 铁皮石斛部分序列 PCR 扩增结果
注: M: Marker; 1: 普通 TRIZOL 法; 2: BIOTEKE 试剂盒法; 3:
TIANGEN 试剂盒法; 4: “去多糖辅助剂+TRIZOL”法
Figure 2 The part of sequence of PCR amplification
Note: M: Marker; 1: Common TRIZOL method; 2: BIOTEKE
kit method; 3: TIANGEN kit method; 4: “Removing
polysaccharides assistant+TRIZOL” method
2 讨论
有关植物组织中 RNA 提取方法的报道已很多，
最常用的有胍法、苯酚法和 CTAB(十六烷基三乙基
溴化铵) 法等，这些方法已广泛用于许多植物组织中
RNA 的提取。但有某些植物组织所含物质种类极为
复杂，尤其是在富含多糖、多酚及一些尚未能确定
的次生代谢产物等情况下，RNA 提取的产量和纯度
常受到影响。由于多糖与 RNA 间的理化性质很相
似，常以复合体形式存在，不易分开(Logemanny et
al, 1987)。在去除多糖的同时，大量的 RNA 也被裹
走了，造成 RNA 的产量减少和降解，而沉淀的 RNA
中也有凝胶状沉淀，难溶于水，或溶解后溶液粘稠
(Lewinsohn et al, 1994)，由于多糖的污染，使 RNA
溶解困难，定量不准，甚至抑制下游酶的反应活性
(Fang et al., 1992)，因此，如何从富含多糖的植物组
织中提取高质量 RNA 很关键。
在本实验中，采用常规方法提不出 RNA，主要
原因在于初提时上清液粘稠，不能很好的和有机相
分离，与铁皮石斛材料多糖含量较高有关。本研究
采用的第三种(除多糖辅助剂+TRIZOL 法 )对于提取
多 糖 含 量 高 的 植 物 组 织 较 为 有 效 ， 由 于
RNAiso-mate for Plant Tissue 试剂中含有高分子聚
合物，能够有效地与组织样品中的多糖结合，并可
以在之后的离心步骤中除去，因此在初提时大量的
RNA 被释放出来，提取的 RNA 浓度是试剂盒的三
倍左右，而且较试剂盒提取法经济实惠。因此，此
方法可以从富含多糖的植物材料中提取高质量、高
浓度的总 RNA。
3 材料与方法
3.1 材料
采自云南省屏边县屏边群鑫石斛种植有限公
司铁皮石斛种植园的一年生幼嫩叶片，从正在生长
的植株上剪下后立即用液氮冷冻，-80℃冰箱保存。
3.2 方法
3.2.1 铁皮石斛 RNA 方法的提取
样品处理：取出上述保存的 100 mg 植物材料
于 DEPC 处理过的研钵中，加入适量的 PVPP 于研
钵中，迅速加入液氮研磨，直至磨成状，在其间保
持研钵中都有液氮，将粉末装入干净的离心管中。
a TRIZOL 法：采用 TaKaRa 公司 RNAiso
Plus(D9108A) ，操作步骤按照说明书进行操作，取
3 µL 进行琼脂糖凝胶电泳。
b 试剂盒法：分别采用 TIANGEN RNAprep pure
Plant Kit (DP432)和百泰克公司通用植物总 RNA 提
取试剂盒 (RP3301)，按照说明书进行操作，取 3µL
进行琼脂糖凝胶电泳。
c 去多糖辅助剂+TRIZOL 法：采用 TaKaRa 公
司 RNAiso-mate for Plant Tissue (D325S)及 RNAiso
Plus (D9108A)提取铁皮石斛总 RNA ，按照说明书
进行操作。
3.2.2 总 RNA 的反转录及纯化
提取总 RNA 中 DNA 的去除采用 fermentas 公
司 RNase free 的 DNaseⅠ，建立 100 µL 的酶解体
系 (10 µg RNA, 10 µL DNaseⅠ , 10 µL 10×buffer, 用
RNase free water 补齐) ，混匀，37 ℃水浴 30 min，
加 10 µL 25 mmol/L EDTA, 65 ℃水浴 10 min。 加
RNase free water 至 420 µL，加水饱和酚：氯仿：
异戊醇( 25:24:1) 400 µL 抽提，取上清液至另一个干
净的离心管中，加氯仿：异戊醇(24: 1) 400 µL 抽提，
移上清至离心管加 1/10 体积 3 mol/L Na AC (pH 5.2)