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后猛等
, 2011,
甘薯
IbSPF1
基因植物表达载体的构建
,
分子植物育种
Vol.9 No.82 (doi: 10.5376/mpb.cn.2011.09.0082)
1599
图
3
获得的
IbSPF1
基因序列与
NCBI
登录序列比对
(
部分序列
)
注
:
红色标识表示的是两基因之间核苷酸差异序列
Figure 3 Comparison of cloned
IbSPF1
gene with NCBI one (part of sequence)
Note: The difference between DNA sequence of cloned
IbSPF1
gene with NCBI one is indicated by red mark
pCAMBIA2300-SWPA2-
IbSPF1
阳性克隆中共有
4
个克隆得到了预期的目的片段
(
图
5)
，结果显示编号
为
3
、
4
、
5
和
6
的克隆连接方向正确。提取质粒后，
用
Bam
HI
酶切以上连接方向正确的阳性克隆，所检
测的六个克隆酶切后皆可以得到大小为
1650 bp
的
片段
(
图
6)
，表明植物表达载体
pCAMBIA2300-Ca-
MV 35S-
IbSPF1
和
pCAMBIA2300-SWPA2-
IbSPF1
已构建成功
(
图
7)
。
图
4
IbSPF1
片段与
pCAMBIA2300-CaMV 35S
的连接方向
鉴定
Figure 4 Orientation identification of
IbSPF1
fragment in
pCAMBIA2300-CaMV 35S
注
: M:
分子量
Marker; 1:
空
pCAMBIA2300-CaMV 35S
载
体
; 4, 8:
阳性克隆
Note: M: Marker; 1: The empty pCAMBIA2300-CaMV 35S
vector; 4, 8: The positive clones
1.3
根癌农杆菌的转化与鉴定
采用冻融法将含有两个不同启动子的重组表
达载体导入农杆菌
EHA105
中，分别得到许多转化
子。以根癌农杆菌中纯化的质粒为模板，用
IbSPF1
基因的特异引物进行
PCR
检测
(
图
8;
图
9)
：所挑取
图
5
IbSPF1
片段与
pCAMBIA2300-SWPA2
的连接方向鉴定
注
: M:
分子量
Marker; 1:
空
pCAMBIA2300-SWPA2
载体
;
3~6:
阳性克隆
Figure 5 Orientation identification of
IbSPF1
fragment in
pCAMBIA2300-SWPA2
Note: M: Marker; 1: The empty pCAMBIA2300-SWPA2
vector; 3~6: The positive clones
图
6
重组质粒
pCAMBIA2300-CaMV 35S (
或
SWPA2)
-
IbSPF1
酶切检测
注
: CaMV35S_p: 4,8; SWPA2_p: 3,4,5,6
Figure 6 Detection of remodeled plasmid pCAMBIA2300-Ca-
MV 35S (or SWPA2)-
IbSPF1
by enzyme restriction
Note: CaMV35S_p: 4,8; SWPA2_p: 3,4,5,6